陳 平,謝劍鋒,,林 琦,趙 琳,張炎華,陳宏彬,翁育偉,,鄭奎城,

禽流感病毒屬于正粘病毒科的甲型流感病毒屬,是重要的人獸共患病病原.不同亞型的禽流感病毒在不同地區(qū)禽類(lèi)中流行,進(jìn)行基因重配,近年來(lái)已造成人感染禽流感病例的不斷出現(xiàn)[1-2].依據(jù)病毒對(duì)禽類(lèi)的致病指數(shù)可分為高致病性和低致病性禽流感病毒.1975年,在美國(guó)首次從綠頭鴨體內(nèi)分離出高致病性H5N6禽流感病毒[3],我國(guó)則最初于2014年3月在廣東省患病的鴨群中分離得到[4].此后,H5亞型逐漸成為我國(guó)南方禽中主要流行的高致病性病毒[5],這不僅造成大量的活禽發(fā)病與死亡,2014年我國(guó)還出現(xiàn)了人感染H5N6的死亡病例[6].2017年12月,三明市報(bào)告了福建省首例人感染H5N6禽流感病例,也是我國(guó)第19例人感染H5N6病例[7].經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí):人感染H7N9、H5N6、H5N1等禽流感主要來(lái)源于禽類(lèi)場(chǎng)所[8-10].由此,本文旨在分析福建省外環(huán)境禽流感病毒H5亞型的分布情況及與人感染H5N6禽流感病毒的相關(guān)性,為人感染H5N6禽流感的防控提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料 從福建省禽流感環(huán)境監(jiān)測(cè)和暴露人群血清監(jiān)測(cè)子系統(tǒng)下載2013－2017年福建省外環(huán)境標(biāo)本信息和禽流感病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果.從中國(guó)流感病毒基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)下載福建省人感染H5N6禽流感病毒基因序列和2013－2017年相關(guān)禽類(lèi)及外環(huán)境禽流感毒株序列.在首發(fā)的人感染H5N6禽流感病例家中的雞舍采集外環(huán)境加強(qiáng)監(jiān)測(cè)標(biāo)本.

1.2 方 法

1.2.1 外環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果分析 下載相關(guān)數(shù)據(jù)信息后整理并建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù),采用SPSS 20.0進(jìn)行卡方檢驗(yàn),分析外環(huán)境不同網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室(福州、廈門(mén)、泉州、漳州、三明、南平)、監(jiān)測(cè)場(chǎng)所(城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)、家禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)、家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)、家禽屠宰加工廠、野生禽鳥(niǎo)棲息地)、標(biāo)本種類(lèi)(水標(biāo)本、籠具表面擦拭標(biāo)本、宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標(biāo)本、糞便標(biāo)本、清洗禽類(lèi)的污水、禽類(lèi)飲用水)、不同季度的甲型禽流感和H5亞型陽(yáng)性檢出率的差異性,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

1.2.2 同源性分析 通過(guò)MEGA6.0軟件將福建省首例人感染H5N6病毒的8個(gè)節(jié)段基因序列與福建省外環(huán)境中H5N6禽流感病毒基因序列進(jìn)行逐一比對(duì)分析,分析其同源性.

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將下載的序列在 MEGA6.0上采用常規(guī)鄰接法(Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建福建省H5N6禽流感病毒HA和NA基因核酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap＝1000).研究過(guò)程中,刪除相同年份具有較高同源性并且位于進(jìn)化樹(shù)相同終末分支上的序列.

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)資料的描述和分析.用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 外環(huán)境監(jiān)測(cè)情況 2013－2017年福建省共采集4 903份外環(huán)境標(biāo)本,甲型禽流感、H5亞型陽(yáng)性檢出率分別為31.92%、4.24%,且在不同網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室(χ2＝101.033)、監(jiān)測(cè)場(chǎng)所(χ2＝45.526)、標(biāo)本類(lèi)型(χ2＝31.751)以及時(shí)間(χ2＝48.174)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05).通過(guò)6個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)(福州、廈門(mén)、泉州、漳州、三明、南平)分析發(fā)現(xiàn),三明H5亞型檢出率最大,為9.83%.城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)H5亞型陽(yáng)性檢出率最高,為5.26%,其次為家禽屠宰加工廠,而其余監(jiān)測(cè)場(chǎng)所的檢出率均較低,說(shuō)明城鄉(xiāng)活禽市場(chǎng)的H5亞型污染最為嚴(yán)重.宰殺或擺放禽肉案板表面的H5亞型陽(yáng)性檢出率最高,為7.66%,糞便標(biāo)本、籠具表面擦拭標(biāo)本、禽類(lèi)飲水、清洗禽類(lèi)的污水標(biāo)本 H5檢出率分別為3.24%、2.81%、4.95%、5.98%,由此看出H5亞型在不同的標(biāo)本類(lèi)型中普遍存在.從時(shí)間分布上看,H5亞型在第一和第四季度較其它兩個(gè)季度的檢出率高,分別為5.39%、6.41%.說(shuō)明冬春季是外環(huán)境中H5亞型的檢出率高峰(詳見(jiàn)表1).

表1 2013－2017年福建省外環(huán)境禽流感病毒監(jiān)測(cè)情況分析Tab.1 Surveillance results of environmental avian influenza viruses in Fujian Province,during 2013－2017

表1 (續(xù))

2.2 同源性分析 在首例病例家中的雞舍中采集的糞便標(biāo)本中分離得到一株H5N6禽流感,命名為:A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017,通過(guò)測(cè)序獲得其HA和NA基因全長(zhǎng)序列,經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)福建首例人感染H5N6禽流感病毒(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)與其HA和NA的核苷酸序列同源性分別高達(dá)100.0%和99.9%,與其余6株2016年外環(huán)境H5N6禽流感病毒HA、NA和NP基因亦存在較高同源性,均在91.8%以上,尤其N(xiāo)A基因的同源性最高,達(dá)95.7%以上;其余5個(gè)內(nèi)部基因節(jié)段的同源性相對(duì)較低,在85.1%～91.9%之間.具體見(jiàn)表2.

表2 A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與福建省外環(huán)境H5N6禽流感病毒核酸同源性比較(%)Tab.2 Homology analysis of nucleotide sequences between A/Fujian-Sanyuan/21099/2017 and environment isolates of influenza A(H5N6)viruses in Fujian Province

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與7株福建外環(huán)境H5N6禽流感病毒株以及其他地區(qū)相關(guān)的禽流感病毒基因序列繪制進(jìn)化樹(shù)圖,見(jiàn)圖1.結(jié)果顯示:福建省人感染H5N6禽流感病毒與A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017病毒進(jìn)化距離最接近,而與其余6株外環(huán)境H5N6禽流感病毒的HA基因處于于不同進(jìn)化分枝中.A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與長(zhǎng)江三角洲地區(qū)的H5亞型,尤其是H5N8亞型聚集在同一分支中,具有更高的相似性,而相對(duì)于2005年三明報(bào)道的首例人感染H5N1病例毒株(A/Fujian/1/2005)序列,在進(jìn)化樹(shù)中處于較遠(yuǎn)的距離.在NA基因進(jìn)化樹(shù)中,A/Fujian-Sanyuan/21099/2017與福建省的7株外環(huán)境H5N6禽流感病毒均處于同一進(jìn)化樹(shù)分枝,具有較高的親緣性.由此說(shuō)明,福建省人感染H5N6禽流感病毒的HA和NA基因可能是分別由長(zhǎng)江三角洲地區(qū)的H5N8亞型與福建省的H5N6亞型進(jìn)化而來(lái).

圖1 福建省H5N6禽流感病毒HA和NA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis of HA and NA genes of the avian influenza A(H5N6)viruses isolated in Fujian Province

3 討 論

人感染禽流感疫情發(fā)生的主要源頭是外環(huán)境禽流感病毒的污染[9].自2013年以來(lái),H5N6亞型禽流感病毒在我國(guó)南部(江西、廣東)和西部(四川)的家禽中傳播流行[4].2014年,中國(guó)、老撾和越南的家禽發(fā)生了H5N6禽流感病毒感染暴發(fā)[11],同年4月,在我國(guó)四川省首次發(fā)現(xiàn)1例人感染H5N6禽流感病例[12],12月廣東省再次報(bào)道確診1例患者[13].福建省于2017年12月首次發(fā)現(xiàn)1例人感染H5N6禽流感確診病例.本研究顯示,2013－2017年,福建省6個(gè)外環(huán)境監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)都普遍存在甲型禽流感病毒及H5亞型的污染,表明福建省外環(huán)境中H5亞型禽流感病毒廣泛存在,且陽(yáng)性的檢出率在冬春季較高,這與人感染禽流感的發(fā)生具有季節(jié)性相符[14].應(yīng)重視外環(huán)境H5陽(yáng)性率較高的局部地區(qū)禽流感防控工作.

自1996年首次在我國(guó)廣東省發(fā)現(xiàn)H5N1亞型病毒以來(lái),就不斷有高致病性H5亞型禽流感病毒從禽類(lèi)中分離出[15].研究發(fā)現(xiàn),H5N1亞型從2008年開(kāi)始逐漸進(jìn)化演變?yōu)榫哂胁煌窠?jīng)氨酸酶的新型重配H5Nx病毒[16].韓國(guó)首次報(bào)道了H5N8亞型禽流感病毒[17],隨后擴(kuò)散到東亞、北美洲及歐洲等地[18].H5N8與 H5N6相似,都屬于 2.3.4.4分枝[19].本研究通過(guò)對(duì)福建省8株H5N6禽流感病毒基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建發(fā)現(xiàn),人感染H5N6禽流感、加強(qiáng)監(jiān)測(cè)標(biāo)本的HA基因與長(zhǎng)江三角洲的H5亞型,尤其是H5N8亞型處于同一進(jìn)化簇中.與我們的研究相似的是Song BM等人發(fā)現(xiàn)從野鳥(niǎo)與家禽中分離出的H5N6、H5N8亞型密切相關(guān)[20].韓國(guó)的一項(xiàng)研究也揭示:從侯鳥(niǎo)分離出的H5N6、H5N8亞型的8個(gè)基因節(jié)段同源性高達(dá)98%～100%[21].對(duì)于NA基因,福建省的8株毒株處于相同進(jìn)化簇中.此外,我們還發(fā)現(xiàn)7株外環(huán)境的HA、NA基因并不具有明顯的地域特征,可能是由于福建地處長(zhǎng)江三角洲與珠江三角洲之間,具有特殊的地理位置,從而沒(méi)有受到某一特定地區(qū)的主導(dǎo)影響.此外,通過(guò)8個(gè)節(jié)段的基因同源性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),福建省2017年發(fā)現(xiàn)的人感染H5N6禽流感病毒與病家采集的加強(qiáng)監(jiān)測(cè)標(biāo)本的HA和NA基因序列幾乎完全一致,可以判斷人感染病例的H5N6病毒來(lái)源于自家活禽或被活禽污染的環(huán)境.該病毒全基因序列與2016年福建省外環(huán)境H5N6病毒具有一定的同源性,且HA基因與2005年三明市報(bào)告的首例人感染H5N1禽流感病毒在進(jìn)化中處于較遠(yuǎn)距離,進(jìn)一步得出人感染H5N6禽流感病毒可能與外環(huán)境長(zhǎng)期存在的H5N6病毒有關(guān),且病毒存在一定的變異變遷,可進(jìn)一步通過(guò)分析全基因的遺傳進(jìn)化特征來(lái)描述病毒可能的變異重組情況.

本文通過(guò)對(duì)外環(huán)境甲型禽流感病毒、H5亞型的監(jiān)測(cè),以及8株H5N6毒株進(jìn)行分析,探討人感染H5N6禽流感與外環(huán)境的關(guān)聯(lián)性.福建省的人感染H5N6禽流感病毒來(lái)源于外環(huán)境中,且可能與長(zhǎng)江三角洲地區(qū)的H5N8亞型及本省的H5N6亞型病毒重配有關(guān).不同亞型的禽流感病毒之間不斷重配產(chǎn)生新型重組病毒,是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,因此,對(duì)于外環(huán)境的監(jiān)測(cè)不可忽視.