游 旅,何尋面,韋小瑜,李世軍,王 斌,黃 荷,唐光鵬,朱 琳,王定明

沙門菌是全球范圍內感染性腹瀉最常見的病原菌之一,是重要的食源性致病菌及人獸共患致病菌.人類可通過進食受到沙門菌污染、且未通過適當烹飪或處理的食品、水,或接觸受到污染的蛋、奶及其制品、肉類、食品等從而感染沙門菌導致沙門菌性腸炎和敗血癥等,常常引起食源性疾病的暴發(fā)[1].近年來,沙門菌感染在全世界普遍流行,在許多國家和地區(qū)已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題.據統(tǒng)計,全球每年估計發(fā)生將近13億因沙門菌導致的急性胃腸炎病例,其中300萬患者死亡[2],在我國,每年因沙門菌感染而致病的約有903萬[3].貴陽市在2010－2015年感染性腹瀉病原菌中發(fā)現,沙門菌是貴陽市引起感染性腹瀉的主要病原菌,且近年由沙門菌引起的食物中毒事件時有發(fā)生[4-7].本研究收集2013－2014年貴陽市4家哨點醫(yī)院感染性腹瀉病例的糞便標本進行沙門菌的分離培養(yǎng)、血清分型及PFGE分子分型,了解貴陽市感染性腹瀉病例中沙門菌的檢出情況、血清型分布及PFGE分子流行特征,為貴陽市沙門菌引起的感染性腹瀉疫情或食物中毒事件、實驗室監(jiān)測及防控預警提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 標本來源 以貴陽市4家哨點醫(yī)院作為監(jiān)測點,其中包括一家兒童醫(yī)院,將符合腹瀉監(jiān)測病例定義的患者即24 h內連續(xù)腹瀉3次及以上且伴有稀便、水樣便、粘液便、膿血便、米泔樣便等糞便性狀異常者,列為感染性腹瀉監(jiān)測病例對象.采集感染性腹瀉病例糞便標本5 m L(或5 g)于50 m L含卡布運送培養(yǎng)基的螺旋管中,24 h內送往腸道病原菌檢測實驗室進行檢測.2013年1月至2014年12月收集到432份感染性腹瀉糞便標本.

1.2 主要試劑和儀器 沙門菌顯色培養(yǎng)基購自法國CHROMAgar公司;亞硒酸鹽煌綠增菌液(SBG)購自北京友康生物公司;API20E生化鑒定條購自法國生物梅里埃公司;沙門菌診斷血清、Swarm Agar誘導軟瓊脂購自丹麥SSI公司;TBE購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白酶K購自德國Merck公司;Xba I酶購自大連寶生物工程有限公司;Seakem Gold瓊脂購自美國LONZA公司;Gel Red染料購自美國Biotium公司;CHEF Mapper脈沖場電泳儀和Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司.

1.3 標本的分離培養(yǎng)、鑒定及血清分型 標本經SBG增菌后接種至沙門菌顯色平板上,36℃培養(yǎng)過夜,從沙門菌顯色培養(yǎng)基上挑取淡紫色菌落接種至克氏雙糖和MIU進行初步生化鑒定后,符合沙門菌初步生化的菌株進一步采用API20E生化鑒定板條進行系統(tǒng)生化鑒定,對明確鑒定為沙門菌的菌株轉種至哥倫比亞營養(yǎng)瓊脂平板進行沙門菌O相血清凝集,并點種至Swarm Agar軟瓊脂平板進行H相血清凝集,生理鹽水作對照.根據Kauffman-White血清分型表確定對應血清型別.

1.4 PFGE分子分型和聚類分析 根據國際PulseNet網絡實驗室公布的沙門菌PFGE標準分型方法,對監(jiān)測中分離的沙門菌進行PFGE分子分型,Xba l進行酶切,以H9812菌株作為參比菌株.應用BioNumerics 7.5軟件對電泳圖譜進行聚類分析,聚類算法為非加權配對平均法(UPGMA).

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析,統(tǒng)計方法包括卡方檢驗和Fisher確切概率法,P＜0.05有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 感染性腹瀉病例中沙門菌的檢出情況及血清型分布 對2013－2014年收集的432例感染性腹瀉患者的糞便標本進行培養(yǎng)及鑒定,結果共檢出沙門菌35株,檢出率為8.10%(35/432),其中腸炎沙門菌檢出率最高為2.55%(11/432),其次為鼠傷寒沙門菌2.08%(9/432),各血清型檢出情況見表1.

2.2 感染性腹瀉病例中沙門菌的流行病學分布特征

2.2.1 性別分布 432例感染性腹瀉病例中男251例、女181例,沙門菌檢出率分別為8.37%(21/251)和7.73%(14/181),男女檢出之比為1.5∶1,差異無統(tǒng)計學意義(χ2＝0.056,P＞0.05).

表1 35株沙門菌的血清分型結果Tab.1 Serovars of 35 Salmonella strains from 432 samples

2.2.2 年齡分布 發(fā)病年齡多集中在0～5歲,檢出率為8.91%(32/359),占沙門菌檢出數的91.43%(32/35);≥6歲大年齡組檢出率為4.11%(3/73),占8.57%,經卡方檢驗兩個年齡組沙門菌檢出率無統(tǒng)計學差異(χ2＝1.880,P＞0.05).

2.2.3 時間分布 432例腹瀉病例據月份分為4組:1－3月份、4－6月份、7－9月份及10－12月份,沙門菌檢出率分別為8.11%(3/37)、2.86%(1/35)、11.30%(26/230)及3.85%(5/130),經 Fisher確切概率法比較P＝0.052,各季度間檢出率比較無統(tǒng)計學差異.

2.3 主要血清型沙門菌PFGE分型及聚類結果采用Bio Numerics7.5軟件,對貴陽市主要血清型沙門菌腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的PFGE圖像進行聚類分析,結果本次研究中分離的11株腸炎沙門菌,經限制性內切酶XbaⅠ進行酶切,PFGE獲得8種帶型,其中JEGX01.CN0007有3株,JEGX01.CN0003有2株,其余均為1株;本次研究中分離的9株鼠傷寒沙門菌,經酶切獲得9種PFGE帶型,見圖1和圖2.

圖1 2013－2014年貴陽市腹瀉病例中腸炎沙門菌PFGE聚類結果Fig.1 Clustering results of PFGE patterns of S.enteritidis strains from infectious diarrheal patients in Guiyang from 2013 to 2014

圖2 2013－2014年貴陽市腹瀉病例中鼠傷寒沙門菌PFGE聚類結果Fig.2 Clustering results of PFGE patterns of S.typhimurium strains from infectious diarrheal patients in Guiyang from 2013 to 2014

3 討 論

本研究顯示,2013－2014年貴陽市感染性腹瀉病例中沙門菌的檢出率為8.10%,高于廣東省、無錫市的檢出率[8-9].35株沙門菌共分為9種血清型,優(yōu)勢血清型為腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌,與廣東、無錫、泰安等地的研究結果一致[8-10],提示在對貴陽市感染性腹瀉的病原監(jiān)測中要重點加強對腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的監(jiān)測.從年齡分布看,發(fā)病年齡多集中在0～5歲,占沙門菌檢出數的91.43%,其檢出率為8.91%,該結果與深圳市龍崗區(qū)2010－2012年感染性腹瀉沙門菌的研究結果一致[11],但與北京市發(fā)病年齡集中在18～40歲不同[12],提示沙門菌感染特征存在地域差異.0～5歲低年齡組的嬰幼兒是貴陽市沙門菌的重點監(jiān)測對象.從時間分布看,各季度均有沙門菌檢出,無明顯的季節(jié)分布趨勢.但檢出沙門菌陽性數在7－9月份居多,提示7－9月感染性腹瀉的高發(fā)季節(jié)也是易感染沙門菌的季節(jié),應加強沙門菌的監(jiān)測.

為進一步了解貴陽市分離的主要血清型沙門菌分子流行病學特征,我們采用PFGE分型方法對沙門菌進行分子分型發(fā)現11株腸炎沙門菌分為8個PFGE型別,菌株間相似性＞85%,優(yōu)勢帶型為JEGX01.CN0007;9株鼠傷寒沙門菌分為9個PFGE帶型,且菌株間相似性僅為54%,揭示貴陽市2013－2014年鼠傷寒沙門菌并未形成流行或聚集性病例,而是高度散發(fā).PFGE分型結果提示貴陽市腹瀉病例沙門菌分離株PFGE型別呈多樣性分布.沙門菌為人獸共患病原菌和食源性病原菌,可通過污染的食物等感染,因此,沙門菌的有效防控應在加強人間病例監(jiān)測的同時,需加強動物沙門菌病的防控以及食源性沙門菌的監(jiān)測.由于本研究中監(jiān)測年限較短,監(jiān)測地區(qū)局限,且僅為感染性腹瀉病例的研究,為全面的反映貴州省沙門菌感染狀況及分子流行病學特征,還需加大監(jiān)測范圍,同時對食品和動物來源的沙門菌進行監(jiān)測分析,以提供全面的監(jiān)測資料,為沙門菌病的防控提供可靠的防控依據.