邵佳月 孫秀威

結(jié)腸癌是癌癥死亡的第二常見原因[1]。結(jié)直腸癌化學(xué)治療的主要用藥是5-fluorouracil(5-FU)和奧沙利鉑。結(jié)腸癌有較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。II期結(jié)腸癌患者手術(shù)后的復(fù)發(fā)率約20%～30%。此外，一些III期癌癥患者接受化學(xué)治療無效，所以嘗試聯(lián)合用藥迫在眉睫。大蒜素是大蒜的主要活性成分之一，是大蒜中最具生物活性的化合物之一，大蒜具有多種生物活性，包括抗動脈粥樣硬化，降壓、抗菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射以及潛在的抗衰老作用[2-3]。大蒜素是新鮮大蒜的主要成分，是由蒜氨酸通過酶作用形成的[4-5]。大蒜素對胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，已作為臨床輔助藥物進(jìn)入臨床治療，激活凋亡信號通路可能是治療惡性腫瘤的有效途徑，但大蒜素發(fā)揮其凋亡作用的機(jī)制尚不完全清楚[6]。鑒于結(jié)腸癌的高發(fā)病率及大蒜素在腫瘤治療中的重要作用，本實驗旨在探討大蒜素與5-FU聯(lián)合應(yīng)對結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

青霉素、鏈霉素和胰酶購自Hyclone公司；胎牛血清、1640培養(yǎng)液與HT29細(xì)胞購自上海中橋新舟公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；大蒜素購自大連美倫公司；5-FU購自Sigma公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；Direct DetectTMSpectrometer-Sample Measuring紅外微定量分析儀購自德國Merck Millipore公司；實時熒光定量PCR儀購自德國Roche公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將結(jié)腸癌HT29細(xì)胞株置于含10% FBS及1%雙抗的1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天換一次液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%以上對細(xì)胞進(jìn)行傳代，采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8檢測HT29細(xì)胞增殖情況

收集對數(shù)生長期HT29細(xì)胞，以每孔4 000個加入96孔板，每孔100 μL。將不同質(zhì)量濃度(2～30 μg/mL)的藥物(5-FU、大蒜素)各100 μL加入實驗孔，另設(shè)立不加藥的陰性對照。每一濃度設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL的CCK-8繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HT29細(xì)胞凋亡情況

取對數(shù)生長期HT29細(xì)胞，接種于6孔板待細(xì)胞平鋪于瓶底80%～90%后，將不同質(zhì)量濃度(2～30 μg/mL)的藥物(5-FU、大蒜素)各1000 μL加入實驗孔，另設(shè)立不加藥的陰性對照。每一濃度設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞一次，2 000 rpm離心5～10 min，棄上清洗滌細(xì)胞；加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106/mL；取195 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機(jī)前5 min再加入5 μL的PI染色，補加200 μL的1×Binding Buffer。

1.5 實時PCR檢測HT29細(xì)胞中相關(guān)mRNA表達(dá)

將HT29細(xì)胞平鋪于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合至80%左右將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、大蒜素組、5-FU組、大蒜素+5-FU組，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清液，PBS洗兩次，收集不同組別的HT29細(xì)胞加入TRIzol裂解液，提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將提取的總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于實時定量PCR檢測，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算mRNA相對量。

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：PTEN：5-ACACCGCCAAATTTAACTGC-3，5-TGAGGTTTCCTCTGGTCCTG-3；mTOR：5-GATTCTCACAACCCAGCGTG-3，5-CGTTAAGGATCAACAAGGCT-3；Bcl-2：5-ATTGGGAAGTTTCAAATCAGC-3，5-TGCATTCTTGGAC GAGGG-3；Bax：5-TTTTGCTTCAGGGTTTCATC-3，5-GACACTCGCTCAGCTTCTTG-3；GAPDH：5-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3，5-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 大蒜素聯(lián)合5-FU對HT29細(xì)胞增殖抑制作用的影響

分別加入質(zhì)量濃度為2，5，10，15，20，25，30 μg/mL大蒜素、5-FU與5-FU聯(lián)合大蒜素處理HT29細(xì)胞48 h。CCK-8法檢測其對HT29細(xì)胞增殖作用影響結(jié)果顯示，不同濃度的大蒜素對HT29細(xì)胞抑制作用隨著濃度的增加抑制作用逐漸增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；不同濃度的5-FU對HT29細(xì)胞抑制作用隨著濃度的增加抑制作用逐漸增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；不同濃度大蒜素+5-FU對HT29細(xì)胞抑制作用隨著聯(lián)合濃度的增加抑制作用逐漸增大；與相應(yīng)濃度大蒜素和5-FU單獨濃度比較，大蒜素+5-FU組對HT29細(xì)胞抑制作用明顯大于大蒜素組和5-FU組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。后續(xù)實驗選取大蒜素、5-FU與5-FU聯(lián)合大蒜素終濃度均為15 μg/mL(表1)。

2.2 大蒜素聯(lián)合5-FU對HT29細(xì)胞凋亡情況的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，大蒜素組、5-FU組和大蒜素+5-FU組均能夠促進(jìn)HT29細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；與大蒜素組和5-FU組比較，大蒜素+5-FU組能夠明顯促進(jìn)HT-29細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 HT29細(xì)胞凋亡情況Figure 1 Apoptotic cells were determined in HT29 cells by flow cytometry

表1 大蒜素與5-FU對HT29細(xì)胞增殖抑制率

2.3 大蒜素聯(lián)合5-FU對HT29細(xì)胞mTOR、PTEN、Bcl-2與Bax mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，大蒜素組、5-FU組和大蒜素+5-FU組處理的HT29細(xì)胞中PTEN和Bax mRNA的表達(dá)明顯增加，mTOR和Bcl-2的mRNA的表達(dá)明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與大蒜素組、5-FU組比較，大蒜素+5-FU組中PTEN和Bax的mRNA的表達(dá)明顯增加，mTOR和Bcl-2的mRNA的表達(dá)明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表3)。

表2 各組細(xì)胞凋亡率的比較Table 2 The apoptosis rates in each

表3 HT29細(xì)胞中mTOR、PTEN、Bcl-2與Bax表達(dá)Table 3 The expression of mTOR，PTEN，Bcl-2 and Bax mRNA in HT29

3 討論

結(jié)腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，目前主要采用手術(shù)、放化療和靶向治療。5-FU和蒽環(huán)類是常用于治療結(jié)腸癌的化療藥物，但療效往往不佳，容易產(chǎn)生耐藥性，主要原因是腫瘤對化療藥物產(chǎn)生的抵抗反應(yīng)，因此本實驗嘗試大蒜素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用來達(dá)到低毒高效的目的。

大蒜素是一個最暢銷的草藥產(chǎn)品，是有機(jī)含硫化合物的天然來源，最近研究最多的是關(guān)于它們的治療應(yīng)用。作為大蒜的活性成分，大蒜素具有廣泛的藥理活性包括抗癌、抗血小板、抗菌、降血脂和預(yù)防作用[7]。大蒜素對胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，已作為輔助藥物進(jìn)入臨床治療，激活凋亡信號通路可能是治療惡性腫瘤的有效途徑。

研究表明，Bcl-2家族成員(如Bax、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2)位于線粒體膜，線粒體膜的通透性改變引發(fā)caspase激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。在非caspase依賴的凋亡途徑中發(fā)現(xiàn)大蒜素誘導(dǎo)人上皮癌細(xì)胞凋亡通過線粒體釋放誘導(dǎo)因子(AIF)和蛋白激酶A[9]。PTEN、PI3K涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞生長和死亡調(diào)控中的核心作用[10]，其通路是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的基礎(chǔ)，為靶向PI3K/Akt通路提供了有力的理論依據(jù)[11]。PTEN基因是PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)控因子[12]。而mTOR是一個集成了生長因子和激素的多個信號的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其控制細(xì)胞生長、增殖、血管生成[13]。mTOR調(diào)控細(xì)胞生長，在PI3K/Akt/mTOR信號通路中處于中心地位。mTOR可通過調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化過程，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化[14]。PTEN通過抑制PI3K/Akt信號通路 反向調(diào)節(jié)mTOR，Akt磷酸化上調(diào)mTOR活性，失調(diào)的mTOR參與腫瘤形成、血管生成和耐藥[13]。一般癌癥患者中mTOR信號通路的激活與腫瘤分化程度及預(yù)后息息相關(guān)，而表皮生長因子和PTEN通路能夠抑制其作用[15]。腫瘤細(xì)胞無限制生長的重要原因就是其生理性和主動性凋亡的能力的喪失，因此有效的抗腫瘤藥物治療不僅要抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而且要誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

體外細(xì)胞試驗顯示，5-FU與大蒜素聯(lián)合對比單獨用藥可以提高HT29細(xì)胞凋亡率?；蛩綑z測顯示5-FU與大蒜素聯(lián)合應(yīng)用可以通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)與上調(diào)Bax表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大蒜素與5-FU聯(lián)合下調(diào)mTOR表達(dá)，提高抑癌基因PTEN基因表達(dá)，對比單獨給藥具有統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，大蒜素有促進(jìn)5-FU對HT29細(xì)胞的致凋亡作用，能增加HT29細(xì)胞對化療藥物的敏感性，對結(jié)腸癌的治療以及預(yù)后都起著積極的作用，值得進(jìn)一步進(jìn)行臨床研究。