李文琪 綜述 耿敬姝 審校

結(jié)直腸癌是世界第三大高發(fā)癌癥，是男性癌癥死亡的第二大原因，女性死亡的第三大原因。結(jié)直腸癌的系統(tǒng)治療在過去的幾十年中逐漸發(fā)展起來，如今患者的總生存期可達(dá)三十個月或更多[1]。除了傳統(tǒng)藥物治療外，靶向治療和免疫治療也逐漸應(yīng)用于結(jié)直腸癌的臨床治療中[2]。隨著結(jié)直腸癌藥物治療譜的不斷擴增，患者的生存能力也更有保障。但隨之而來的，也為患者如何選擇最適合自己病情的個體化治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。

結(jié)直腸癌主要由兩條分子通路引起，一條是染色體不穩(wěn)定性(Chromosome instability，CIN)通路(80%～85%)，另一條是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite instability，MSI)通路(約15%)[3]。其中RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路是CIN中最重要的組成部分之一[4]，而RAS/RAF基因?qū)@條通路的狀態(tài)有著極大的影響。但已有大量研究證實，RAS/RAF突變的患者，對貝伐單抗及西妥昔單抗治療效果不佳，而高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H)患者同樣對5-FU類藥物治療不敏感。即傳統(tǒng)治療方式無法滿足這些小亞型患者，如何改善這些患者的生存預(yù)后依舊是當(dāng)今研究的重中之重。本文將重點討論RAS/RAF突變及MSI-H狀態(tài)患者的最新治療進(jìn)展。

1 CIN通路檢測及治療的最新進(jìn)展

1.1 RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路

RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路中的RAS和RAF基因都是原癌基因，均以兩種狀態(tài)存在，一種是突變型，另一種是野生型。當(dāng)任一基因發(fā)生突變時，都可能會激活腺瘤-癌序列，使黏膜腺體增生，繼而可能會形成腺瘤，進(jìn)一步可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。即RAS或者RAF突變發(fā)生的時候，下游基因不再受上游基因調(diào)控，使整個通路處于活躍狀態(tài)，無限增殖，促使腫瘤形成[5]。此外，由于EGFR是該通路的上游因子，所以當(dāng)RAS或RAF突變的時候，下游通路激活，導(dǎo)致結(jié)直腸癌接受抗EGFR傳統(tǒng)治療的效果不佳。

1.2 RAS突變

1.2.1 RAS突變的檢測 RAS是一種異質(zhì)性基因，由KRAS、NRAS、HRAS組成。隨著檢測技術(shù)的革新，近年來RAS基因突變的檢出率與過去有了明顯的不同。過去，我們通常采用傳統(tǒng)桑格測序法對RAS基因進(jìn)行檢測。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為僅35%～45%的結(jié)直腸癌患者中存在RAS突變，且突變高發(fā)于KRAS 2號外顯子的12/13密碼子上[6]。隨著研究的進(jìn)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)并非所有當(dāng)時檢測非突變的患者都可以從抗EGFR治療中獲益，這可能是由于檢測方法落后導(dǎo)致的RAS突變假陰性造成的。隨著敏感性更高的高通量測序(Next generation sequencing，NGS)技術(shù)的普及，我們可以對RAS基因進(jìn)行更準(zhǔn)確、全面的分析。最新的研究顯示，經(jīng)NGS的RAS擴大檢測時(對KRAS/NRAS的2/3/4號外顯子同時檢測)，RAS突變率已上升至56%左右[7]。RAS突變檢測已經(jīng)被納入2017年晚期結(jié)直腸癌治療的NCCN指南中[8](圖1)。

圖1 各分型結(jié)直腸癌的最新治療方式Figure 1 The latest treatment for various types of colorectal cancer

1.2.2 RAS突變治療的進(jìn)展 結(jié)直腸癌患者通常采用FOLFOX/CAPOX或FOLFIRI/CAPIRI聯(lián)合表皮生長因子受體抑制劑作為其傳統(tǒng)的一線治療方法，但這種治療方案通常僅對RAS野生型患者有效，RAS突變型患者幾乎不能從該治療方案中獲益。所以RAS突變型患者的最佳治療方案仍需進(jìn)一步研究。近期，免疫治療為RAS突變型患者提供了一種治療的新思路。Tran等對RAS G12D突變的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行CD8+T細(xì)胞輸注的臨床試驗[9]。輸注T細(xì)胞的患者，腫瘤體積明顯縮小且患者總生存期升高。隨后大多學(xué)者研究證實，T細(xì)胞對突變腫瘤抗原的應(yīng)答作用可能會為RAS突變的結(jié)直腸癌患者提供良好的治療效果。在此基礎(chǔ)上Pek等[10]研究發(fā)現(xiàn)，倍美替尼(MEK抑制劑)可以通過增加腫瘤細(xì)胞上MHC1的表達(dá)來促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的積累，以此增加KRAS突變型結(jié)直腸癌患者對PD-L1抑制劑的敏感性。這些結(jié)論使RAS從預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢灶A(yù)測是否支持新型免疫治療的具有積極意義的生物標(biāo)志物(表1)。

表1 各檢查位點的最新治療方案及其主要效果Table 1 The latest treatment options and their main effects at each site

1.3 RAF突變

1.3.1 RAF突變的檢測 RAF是RAS的下游基因，絕大多數(shù)學(xué)者表示RAS和RAF兩種基因不可能同時發(fā)生突變。但個別大樣本實驗證實，RAS/RAF存在共同突變的可能[11-12]。RAF突變具有同質(zhì)性，其突變幾乎均發(fā)生在BRAF V600E位點上[13]。最新的研究顯示，經(jīng)NGS測序約有14%的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者和8%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的BRAF發(fā)生突變[14](圖1)。

1.3.2 RAF突變治療的進(jìn)展 已有大量研究顯示，RAF突變的患者生存期較短，疾病進(jìn)展較快，復(fù)發(fā)風(fēng)險高，是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的標(biāo)志。一則Meta分析顯示，RAF可以作為抗EGFR治療抵抗的獨立預(yù)測指標(biāo)[15]。雖然BRAF突變的結(jié)直腸癌患者接受傳統(tǒng)療法療效差，但新型敏感藥物的研發(fā)在近三年已取得了極大的進(jìn)步。早期Corcoran等研究證實，EGFR抑制劑、BRAF抑制劑和MEK抑制劑均有改善BRAF突變患者預(yù)后的效果[16]。大多數(shù)學(xué)者支持此結(jié)果，并表示，三藥的聯(lián)合使用效果更佳。但也有少許實驗表示反對：BRAF抑制劑的單藥使用僅可延長5%患者的生存時間，而BRAF抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑的雙藥使用效果也不盡如人意[17]。此外，近期Kopetz的團隊明確提出：BRAF V600E抑制劑聯(lián)合伊立替康及西妥昔單抗治療相較單純使用伊立替康聯(lián)合西妥昔單抗治療的無進(jìn)展生存時間有顯著的延長，由2個月提高至4.4個月，是目前RAF突變的結(jié)直腸癌最佳的治療方式[18]。EGFR/BRAF或BRAF/MEK的雙重抑制是BRAF突變的結(jié)直腸癌患者最有前途的治療方向，值得我們繼續(xù)深入研究(表1)。

2 MSI通路檢測及免疫治療的最新進(jìn)展

MSI是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的另一大通路，雖然所占比例較CIN通路小很多，但由于其對預(yù)后及治療具有明確的指導(dǎo)作用，所以不可忽視。

2.1 MSI的表達(dá)

DNA錯配修復(fù)基因(dMMR)啟動子甲基化導(dǎo)致體內(nèi)的基因修復(fù)功能異常，造成整個基因組中重復(fù)元件的擴增，這種異常的生物學(xué)狀態(tài)稱為MSI狀態(tài)[19]。一般體內(nèi)存在三種狀態(tài)：微衛(wèi)星高不穩(wěn)定性(MSI-H)、微衛(wèi)星低不穩(wěn)定性(MSI-L)和微衛(wèi)星穩(wěn)定性(MSS)。絕大多數(shù)MSI-H狀態(tài)下的結(jié)直腸癌是散發(fā)性結(jié)直腸癌，其余的為遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(林奇綜合癥)[20]。林奇綜合征患者的BRAF基因極少發(fā)生突變，當(dāng)MSI-H狀態(tài)下的BRAF基因為突變型時，結(jié)直腸癌可基本排除家族遺傳的可能[21]。

2.2 MSI治療的最新進(jìn)展

目前的研究結(jié)果表明，MSI狀態(tài)下的結(jié)直腸癌預(yù)后較好，但5-FU類藥物對其治療效果不佳[21]。直到2015年，Le等人的研究表明MSI狀態(tài)可以指導(dǎo)患者進(jìn)行免疫治療[22]。對結(jié)直腸癌使用Pembrolizumab(PD-1抑制劑)進(jìn)行治療時，MSI-H患者的總緩解率和無進(jìn)展生存率分別為40%和78%，但在MSS患者中則分別為0和11%。即PD-1抑制劑可以明顯改善MSI-H狀態(tài)患者的預(yù)后，但對MSS狀態(tài)下患者的治療效果不佳。這一發(fā)現(xiàn)開啟了結(jié)直腸癌的免疫治療方法，在結(jié)直腸癌的治療中具有里程碑式的意義。

自從這一里程碑意義發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的學(xué)者對“免疫檢查點阻斷”進(jìn)行研究，并已取得了很好的進(jìn)展[23]。對于MSI-H患者是否應(yīng)該在傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上開展免疫治療也有了比較肯定的答案。2017年胃腸研討會上，有學(xué)者稱Atezolizumab(PD-L1抑制劑)與貝伐單抗聯(lián)合使用，可以治愈40%的MSI-H的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[24]。Overman等也更新了CheckMate-142實驗的最新進(jìn)展，表明31.1%的MSI-H患者可通過Nivolumab(PD-1抑制劑)改善預(yù)后[25]，無進(jìn)展生存期可達(dá)9.6個月。結(jié)直腸癌免疫治療的臨床實驗數(shù)據(jù)較少，但也有研究表明[26]，免疫抑制劑在結(jié)直腸癌治療中安全性較高，且有明顯抗腫瘤作用。如今，MSI已成為FDA批準(zhǔn)的PD-1抑制劑使用與否的主要判定靶點(表1)。

2.3 腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutation burden，TMB)的檢測意義

TMB是指人體龐大的基因組中，每兆堿基(MB)發(fā)生的基因異常改變的總數(shù)[27]。它是繼MSI后又一較成熟的免疫檢查點抑制劑的生物標(biāo)志物，與MSI存在包含關(guān)系。癌癥基因組圖譜(TCGA)顯示：16%的結(jié)直腸癌患者在修復(fù)自發(fā)DNA損傷的機制上存在缺陷，這類患者的腫瘤突變負(fù)荷明顯增加。其中，75%是由于MSI-H狀態(tài)導(dǎo)致，其余25%則由體細(xì)胞MMR基因和聚合酶ε(POLE)突變引起[28]。我們可以得出結(jié)論：大多數(shù)TMB-H的患者常表現(xiàn)為MSI-H狀態(tài)。有實驗顯示，TMB-H與右半結(jié)腸癌密切相關(guān)。右半結(jié)腸腫瘤平均突變負(fù)荷為24.5個突變/MB，高于左半結(jié)腸腫瘤(5.5個突變/MB)和直腸腫瘤(5.9個突變/MB)[29]。數(shù)值差異與MSI-H在結(jié)直腸癌中的分布情況基本一致。

TMB增高的患者，其基因組中突變的基因數(shù)量明顯增高，繼而會在體內(nèi)產(chǎn)生數(shù)量龐大的非自身抗原的新抗原。所以TMB-H的結(jié)直腸癌，被免疫系統(tǒng)識別的可能性大，更容易引起強烈的免疫反應(yīng)，對免疫抑制劑的敏感程度也就越高[30-31]。先前也有人提出，突變負(fù)荷升高的患者，腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞數(shù)量增高，這也可能是TMB-H患者更適合免疫治療的原因之一[32]。已有研究證實，在小細(xì)胞肺癌中TMB-H的患者可以從PD-1治療中獲益的可能性大。且其對PD-1的治療效果的預(yù)測優(yōu)于MSI這一指標(biāo)[33]。我們可以推測，這種規(guī)律在結(jié)直腸癌中同樣適用。一項大樣本實驗顯示[34]，部分MSS的結(jié)直腸癌患者對PD-1的治療也有長期的高應(yīng)答效果，而TMB的檢查可以幫助這類患者避免錯過免疫治療這一寶貴機會。

3 RAS/RAF突變與MSI狀態(tài)的關(guān)系

3.1 三者間表達(dá)的關(guān)系

大多學(xué)者認(rèn)為，RAS在MSI-H狀態(tài)下較MSS狀態(tài)下突變率略低；而RAF突變率在MSI-H狀態(tài)下明顯升高，甚至可以達(dá)到MSS狀態(tài)下的5～10倍。即RAF突變率與MSI-H狀態(tài)之間呈正相關(guān)[35]。但也有少數(shù)學(xué)者認(rèn)為RAS突變率與MSI-H狀態(tài)間沒有明確相關(guān)性，KRAS 13號密碼子在MSI狀態(tài)下的突變率也可能高于MSS狀態(tài)[36]。

3.2 三者間預(yù)后的關(guān)系

過去對于結(jié)直腸癌預(yù)后的評價一直局限于單因子評價。主流觀點是RAS/RAF兩者中任一基因發(fā)生突變則預(yù)后較差，而MSI-H狀態(tài)下結(jié)直腸癌預(yù)后相對較好[37]。近年來，越來越多的學(xué)者嘗試使用多因素對結(jié)直腸癌預(yù)后進(jìn)行綜合評價。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，MSI-H對結(jié)直腸癌預(yù)后的正影響要遠(yuǎn)大于RAS、RAF突變帶來的負(fù)影響，即MSI-H狀態(tài)下，無論RAS/RAF的突變狀態(tài)如何，結(jié)直腸癌預(yù)后較好[38]。也有個別學(xué)者認(rèn)為，即使在MSI-H狀態(tài)下，RAF突變的結(jié)直腸癌預(yù)后依舊極差[39]。

3.3 治療的空白

雖然RAS/RAF突變與MSI的狀態(tài)間的表達(dá)情況和對結(jié)直腸癌預(yù)后的影響已有大量文獻(xiàn)報道，但關(guān)于三者綜合治療用藥的文獻(xiàn)寥寥無幾。如今對于單一因子狀態(tài)用藥的選擇正在不斷革新，但均處于臨床試驗狀態(tài)，未規(guī)范化寫入指南。多因子聯(lián)合指導(dǎo)用藥的研究更為復(fù)雜，但對其研究卻勢在必行，急需大量臨床試驗來彌補這一領(lǐng)域的空白。這是未來結(jié)直腸癌研究的重要方向，以規(guī)范不同分子狀態(tài)下結(jié)直腸癌的合理用藥。

4 小結(jié)與展望

整個外顯子測序法(WES)或全基因組測序法(GWS)是更全面的基因測定方法，他們可以對RAS/RAF等基因的表達(dá)進(jìn)行更全面的擴大測序，也可以更精準(zhǔn)的評估患者的MSI/TMB及其他免疫檢查點抑制劑的生物標(biāo)志物。如何將這兩種測序法普及是患者選擇更精確的治療方法的關(guān)鍵。此外研發(fā)突變亞型的治療新藥，尋找更多的靶向治療及免疫抑制劑的檢測位點，以及如何將TMB應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療，都是當(dāng)今學(xué)者仍需努力研究的方向。雖然現(xiàn)如今大多數(shù)結(jié)直腸癌患者仍會選用傳統(tǒng)的非選擇性細(xì)胞毒性化療藥物進(jìn)行治療，但越來越多的擁有某種基因改變的小亞型患者會針對突變進(jìn)行靶向治療。相信選擇性靶向藥物治療及免疫治療終將取代傳統(tǒng)的非選擇性細(xì)胞毒性化療。所以，我們應(yīng)持續(xù)對影響結(jié)直腸癌預(yù)后的分子進(jìn)行研究，為患者帶來更好的治療方案。