楊新階，王婧筱，王 琳，遲笑怡，遲佳琦，周 天，劉銅華，胡凱文＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究所 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100078；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點實驗室 北京 100029）

肺癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率目前仍居高不下[1,2]。盡管以EGFR-TKIs為代表的靶向藥物極大地改善了肺癌的治療和預(yù)后，但化療在臨床治療中仍然占據(jù)十分重要的地位，而化療耐藥的發(fā)生是導(dǎo)致臨床治療失敗、疾病進(jìn)展和預(yù)后不良的主要原因[3,4]。

腫瘤耐藥發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ATP-Binding Cassette Transporters，ABCs）高表達(dá)、肺耐藥相關(guān)蛋白（Lung resistance-related protein，LRP）表達(dá)上調(diào)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferases，GSTs）作用增強(qiáng)以及DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II（DNA topoisomerase II，Topo II）低表達(dá)等[5]。

在上述機(jī)制中，ABC的藥物泵出作用最為重要，其逆轉(zhuǎn)劑研究最為深入[6，7]。目前，第三代逆轉(zhuǎn)劑Tariquidar專門針對ABC蛋白跨膜片段的半胱氨酸交聯(lián)區(qū)并發(fā)揮作用[8]。據(jù)報道，A549/DDP耐藥的發(fā)生可能與ABC家族中ABCB1和MDR1基因的高甲基化有關(guān)[9]。其產(chǎn)物為耐藥相關(guān)的ABC蛋白，均為Tariquidar作用靶點。

Tariquidar開發(fā)伊始，因其在體內(nèi)外試驗的中良好耐受性和療效而被寄予厚望[10]。但其臨床試驗均以失敗告終[11]。腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)藥物開發(fā)進(jìn)入了平臺期。有數(shù)據(jù)顯示，1999年至2008年的18年間，美國FDA批準(zhǔn)上市進(jìn)入臨床的小分子化合物類藥物中，36%為天然存在的化合物及其衍生物[12]。中藥體系龐大，涵蓋物質(zhì)廣泛，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的有效成也存在于中藥之中[13]。

我們挑選既往報道具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用的5種中藥標(biāo)準(zhǔn)品：川芎嗪、苦參堿、鹽酸小檗堿、北豆根堿（蝙蝠葛堿）和冬凌草甲素等（表1）。這些標(biāo)準(zhǔn)品對白血病耐藥細(xì)胞、胃癌耐藥細(xì)胞、乳腺癌耐藥細(xì)胞等均具有一定的逆轉(zhuǎn)效果，但對于肺癌耐藥細(xì)胞株的逆轉(zhuǎn)作用尚不明確。本研究以人類肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP為模型，研究其對肺癌耐藥的逆轉(zhuǎn)效果，為解決臨床肺癌耐藥問題、開發(fā)新型耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供初步依據(jù)。

表1 實驗選擇的中藥標(biāo)準(zhǔn)品

1 實驗儀器和材料

1.1 實驗儀器

HERACell 150i恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，USA），HDLDL-CJ-2ND I型潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）,Olympus IX7型倒置顯微鏡（Olympus，Japan），Sigma 3K15型低溫高速離心機(jī)（Sigma，USA），Promega E9032型酶標(biāo)儀（Promega，USA），Sartorius R200D 型 分 析 天 平（Sartorius，Germany），DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 實驗材料

RPMI Medium 1640培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)，胎牛血清（Gibco，USA），TRYPSIN-EDTA 胰酶消化液（Invitrogen），青霉素-鏈霉素混合液（Invitrogen，USA），磷酸鹽緩沖液（PBS，Invitrogen，USA），25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning，USA），15mL離心管（Corning，USA），Cell Counting Kit 8（CCK-8，Dojindo，Japan，批號：CK04-500）等。

1.3 藥物與細(xì)胞

順鉑（DDP，Bioruler，USA，批號：RH66694-100 mg），Tariquidar（Selleck，USA，批 號 ：S8082），川 芎 嗪（Bioruler，USA，批號：RB14186-20 mg），鹽酸小檗堿（Bioruler，USA，批 號 ：RB11146-20 mg），苦 參 堿（Bioruler，USA，批號：RB10662-20 mg），蝙蝠葛堿（Bioruler，USA，批號：RB15517-20 mg），冬凌草甲素（Bioruler，USA，批號：RB13949-20 mg）

人肺腺癌細(xì)胞株A549，購自ATCC上海細(xì)胞庫，A549耐順鉑細(xì)胞藥株（A549/DDP）購自北納聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)研究院（BeNa Culture Collection，北京）,該細(xì)胞株為A549細(xì)胞通過階梯誘導(dǎo)法獲得，歷時12個月。以上細(xì)胞均儲存于液氮存儲系統(tǒng)之中。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將儲存于液氮中的A549和A549/DDP細(xì)胞迅速置于37℃水浴鍋中5 min內(nèi)復(fù)蘇。立即移入含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的1 640完全培養(yǎng)基中，反復(fù)吹打混勻，4℃，1 000rpm離心5 min后棄上清，加入5 mL 1 640完全培養(yǎng)基后混勻，移入25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長情況，待A549細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時，用PBS清洗2次，加入1 mL胰蛋白酶消化，鏡下觀察細(xì)胞變圓時加入2 mL 1 640完全培養(yǎng)基停止消化，收集細(xì)胞置于15 mL離心管中，4℃，1 000 rpm離心5 min后棄上清，培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)。A549/DDP細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，更換含5.67 μM（μ2 g/ml）DDP的完全培養(yǎng)液，部分細(xì)胞死亡漂浮，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以維持A549/DDP對順鉑的耐藥性。根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗，A549/DDP細(xì)胞實驗前用不含DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。

2.2 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線

為確定96孔板每孔細(xì)胞接種數(shù)量、貼壁孵育時間、加入CCK-8后的O.D.值讀數(shù)時間等，需制作A549、A549/DDP細(xì)胞的增值標(biāo)準(zhǔn)曲線。將2株細(xì)胞分別梯度濃度接種于96孔板中（周圍一圈孔加入PBS），設(shè)計梯度為：10 000、5 000、2 500、1 250、625/孔，貼壁生長24 h后加入CCK-8，間隔讀取450 nm處的吸光值，間隔時間設(shè)計為15 min。分別以時間（min）為橫軸、O.D.（450 nm）為縱軸制作曲線，以細(xì)胞濃度為橫軸、O.D.（450 nm）為縱軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此確定適宜的細(xì)胞接種數(shù)量和O.D.值讀數(shù)時間。

2.3 A549/DDP耐藥指數(shù)測定

取對數(shù)生長期的A549、A549/DDP細(xì)胞，按照每孔5 000個接種于96孔板中，培養(yǎng)箱貼壁生長24 h，加入梯度濃度含順鉑的1 640培養(yǎng)基。順鉑設(shè)計5個梯度濃度（每個濃度5個復(fù)孔）：A549細(xì)胞100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM；A549/DDP 細(xì)胞 2 560 μM、1 280 μM、640 μM、320 μM、160 μM。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，恒溫箱孵育60 min，讀取450 nm處O.D.值。根據(jù)CCK-8試劑盒說明計算細(xì)胞的活性及半數(shù)抑制濃度（Half inhibitory concentration，IC50）IC50。

耐藥指數(shù)=IC50(A549/DDP)/IC50(A549)。

2.4 A549/DDP對中藥標(biāo)準(zhǔn)品耐受實驗

既往研究報道[14]，有機(jī)溶劑DMSO體積濃度＜0.1%或AEA體積濃度＜1%時，A549細(xì)胞增殖未見明顯受益。但A549/DDP細(xì)胞對其耐受性并不明朗，本研究取0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%五個體積濃度梯度的二甲基亞砜（DMSO）和無水乙醇（AEA），用CCK8法確定A549/DDP對其耐受情況。

將選定的中藥標(biāo)準(zhǔn)品溶解于不含血清的1 640培養(yǎng)基中，不溶于水的標(biāo)準(zhǔn)品加入DMSO或AEA助溶。等比梯度濃度配制工作液。取對數(shù)期A549/DDP細(xì)胞，5 000/孔接種于96孔板中，貼壁生長24 h后給予梯度濃度中藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液，恒溫培養(yǎng)箱孵育24h，加入CCK8溶液，37℃孵育60 min后讀取450 nm處吸光值。回歸分析計算中藥標(biāo)準(zhǔn)品對A549/DDP細(xì)胞的5%抑制濃度（5%inhibitory concentration，IC5）、10%抑制濃度（10%inhibitory concentration，IC10）以及 IC50。選取IC5作為逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞耐藥的工作濃度。

2.4 中藥標(biāo)準(zhǔn)品逆轉(zhuǎn)耐藥實驗

選取對數(shù)期A549/DDP細(xì)胞接種于96孔板中，貼壁后加入含有工作濃度中藥標(biāo)準(zhǔn)品的1 640完全培養(yǎng)基，37℃恒溫孵育24 h，棄去含藥培養(yǎng)基，加入含梯度濃度順鉑的1 640培養(yǎng)基，孵育24 h后進(jìn)行CCK8實驗，計算IC50，對比逆轉(zhuǎn)實驗前后IC50值，計算逆轉(zhuǎn)指數(shù)（Reversal Index）。除中藥標(biāo)準(zhǔn)品之外，本研究以Tariquidar為陽性對照藥，其工作濃度為1 μM，干預(yù)方法及CCK8實驗同上。

2.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 7.0分析并作圖，實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)加減方差（±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗；P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01有顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

A549/DDP是在A549細(xì)胞系基礎(chǔ)上通過階梯誘導(dǎo)傳代獲得的細(xì)胞株，經(jīng)過長時間培養(yǎng)，有老化趨向，其代謝較A549細(xì)胞略緩慢（圖1a）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及吸光值，確定后續(xù)實驗中96孔板接種細(xì)胞數(shù)目為5 000/孔，CCK8實驗讀數(shù)時間為60 min（圖1b，c）。

圖1 細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 耐藥指數(shù)

DDP對A549細(xì)胞的IC50為32.71±2.8 μM，DDP對A549/DDP 細(xì)胞的 IC50為 1040±30.1 μM，耐藥指數(shù)（resistance index，RI）為31.79（圖2）。

3.3 A549/DDP對中藥標(biāo)準(zhǔn)品耐受

實驗結(jié)果顯示，有機(jī)溶劑助溶，DMSO的體積百分比＜0.1%或者AEA的體積百分比＜1%時，A549/DDP細(xì)胞增殖未見明顯受抑（圖3a）。故中藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制時，應(yīng)將有機(jī)助溶劑的體積百分比控制在此范圍之類，以免影響實驗結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)，A549/DDP細(xì)胞對川芎嗪（Tep.）和苦參堿（Mat.）耐受良好，高濃度下（500 μM）仍未見明顯生長受抑，均選取100 μM作為工作濃度，其余中藥標(biāo)準(zhǔn)品對A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制效果（圖3b）及確定的工作濃度見下表2。

3.4 逆轉(zhuǎn)A549/DDP順鉑耐藥

工作濃度中藥標(biāo)準(zhǔn)品各組IC50與A549/DDP組比較具有顯著性差異，說明其對A549/DDP細(xì)胞的耐藥性具有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用。陽性對照藥物Tariquidar(Tari.)的逆轉(zhuǎn)效果與既往文獻(xiàn)報道相近。（表3、圖4）

圖2 細(xì)胞對DDP的耐受情況

圖3 A549/DDP對DMSO、AEA的耐受（a），鹽酸小檗堿、北豆根堿（蝙蝠葛堿）和冬凌草甲素對A549/DDP細(xì)胞增的抑制作用（b）

表2 A549/DDP對中藥標(biāo)準(zhǔn)品的耐受情況

4 討論

腫瘤耐藥的發(fā)生是多因素、多機(jī)制共同作用的結(jié)果[6]。主要包括：增強(qiáng)細(xì)胞膜上ATP依賴的泵蛋白（ABC蛋白）的表達(dá)，將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出；改變腫瘤細(xì)胞的藥物吸收特性，減少抗腫瘤藥物吸收；增加抗腫瘤藥物的代謝速度；改變抗腫瘤藥物的靶點；通過改變細(xì)胞周期檢測點和影響凋亡通路阻礙細(xì)胞的死亡。Tariquidar能特異性地拮抗ABC轉(zhuǎn)運通道，并在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)耐藥相關(guān)ABC的表達(dá)[15]。盡管如此，臨床上腫瘤化療耐藥的現(xiàn)狀仍舊未能得到絲毫的緩解。本實驗中，Tariquidar對A549/DDP具有逆轉(zhuǎn)效果（圖4），提示其耐藥機(jī)制可能與ABC高表達(dá)相關(guān)。而Tariquidar逆轉(zhuǎn)以后的A549/DDP細(xì)胞仍具有一定的順鉑耐受性，說明其耐藥性的發(fā)生可能是多因素作用的結(jié)果。

圖4 中藥標(biāo)準(zhǔn)品及陽性逆轉(zhuǎn)劑對A549/DDP耐藥逆轉(zhuǎn)效果對比。

表3 中藥標(biāo)準(zhǔn)品及陽性對照藥物對A549/DDP耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果

中藥及復(fù)方被報道具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥活性由來已久[13,16]。川芎嗪能逆轉(zhuǎn)血液腫瘤細(xì)胞K562和肝癌細(xì)胞HepG2對阿霉素的耐藥性，其作用機(jī)制與川芎嗪下調(diào)ABCB1的表達(dá)有關(guān)[17,18]；苦參堿通過抑制P-gp蛋白表達(dá)、降低P-gp ATP酶活性來增加阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞BIU-87和乳腺癌細(xì)胞MCF-7對阿霉素的耐受[19,20]；鹽酸小檗堿不僅能通過下調(diào)P-gp的表達(dá)逆轉(zhuǎn)血液腫瘤細(xì)胞K562的耐藥性，而且還能通過下調(diào)Pho P和Pho R基因的表達(dá)逆轉(zhuǎn)結(jié)核桿菌的細(xì)菌耐藥性[21,22]；北豆根堿能通過抑制自噬溶酶體的降解增強(qiáng)Hela細(xì)胞對喜樹堿的敏感性[23]；冬凌草甲素通過下調(diào)MDR1基因及P-gp的表達(dá)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞SGC7901、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和血液腫瘤細(xì)胞K562的耐藥性[24-25]。但是，這些藥物對肺癌耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制尚不明確。

本實驗中所用細(xì)胞模型A549/DDP是在A549細(xì)胞系基礎(chǔ)上，用DDP濃度遞增法經(jīng)過長時間誘導(dǎo)所獲得。相比較于親代細(xì)胞，A549/DDP在代謝和增殖速度上呈現(xiàn)出明顯的老化趨勢（圖1）。經(jīng)過長期的順鉑刺激，A549/DDP的耐藥性也明顯強(qiáng)于A549細(xì)胞系（P＞0.01）（圖2）。本實驗所選中藥標(biāo)準(zhǔn)品中，川芎嗪和苦參堿的細(xì)胞毒性較弱，其余三種標(biāo)準(zhǔn)品均表現(xiàn)出劑量依賴的細(xì)胞毒性。中藥標(biāo)準(zhǔn)品作用于A549/DDP的結(jié)果顯示，所遴選的5種中藥標(biāo)準(zhǔn)品均能有效逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的耐藥性（與A549/DDP模型比較，P＞0.01）。為今后解決臨床肺癌耐藥、為開發(fā)出新的耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供線索。efflux pump inhibitor.Expert Rev Anticancer Ther,2007.7(4):p.447-59.