張曉芬，宋 靜，李洪昌，陳亞峰，奉典旭＊＊

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院 鄭州 450046；2.河南省柘城縣人民醫(yī)院護(hù)理部 柘城 476220；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院普外科 上海 200062）

黃連膏最早見(jiàn)于外科專著《劉涓子鬼遺方》，至清代《醫(yī)宗金鑒》形成了用于中醫(yī)外科治療皮膚創(chuàng)面疾病的“經(jīng)典”處方，由黃連、黃柏、生地黃、當(dāng)歸、姜黃五味藥組成。其中黃連、黃柏清熱解毒，利濕排膿；生地清熱涼血養(yǎng)陰；當(dāng)歸、姜黃活血化瘀，袪腐生新，全方共奏清利濕熱、活血化瘀，袪腐排膿生新的作用，主治濕熱諸瘡。黃連膏在臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著，本課題組在前期已經(jīng)證實(shí)黃連膏能夠增加成纖維細(xì)胞生成、提高TGF-β、膠原蛋白的蛋白含量而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[1]。但對(duì)于其治療的作用機(jī)制，特別是在細(xì)胞、分子和基因的水平的實(shí)驗(yàn)研究還有待探討，因此本研究從黃連膏治療創(chuàng)面愈合的機(jī)理及其對(duì)小鼠創(chuàng)面血管生成的影響進(jìn)行探尋，以其為臨床運(yùn)用黃連膏提供更充實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用生藥材均購(gòu)自中國(guó)上海同仁堂制藥公司，上述藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照2005年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部；麻油購(gòu)自河南南陽(yáng)和潤(rùn)糧油有限公司。藥材黃連18 g、黃柏18 g、生地黃60 g、當(dāng)歸30 g、姜黃18 g浸入720 g麻油中浸泡72小時(shí)，將麻油及藥入鐵鍋內(nèi)，文火使藥料炸至表面呈深褐色，中部焦黃為度，在無(wú)菌操作臺(tái)濾去藥渣，待溫度降至適宜90℃時(shí)，再將50 g蜂蠟加入其中，文火徐徐收膏、裝瓶，常溫保存?zhèn)溆??；|(zhì)膏配置方法同上，主要成分為麻油和蜂蠟（按麻油、蜂蠟72∶5配置）。CD-31兔來(lái)源多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Alexa flour 488標(biāo)記的羊抗兔二抗、pAKTs308、pAKTs437、AKT兔來(lái)源單克隆抗體均購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)CST公司，兔多克隆抗體VEGF-A，兔單克隆抗體eNOS購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。Real time RCR擴(kuò)增儀Vii ATM7型購(gòu)自美國(guó)ABI公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自中國(guó)Haier公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 動(dòng)物及分組處理

C57BL/6J雄性健康無(wú)特殊病原體級(jí)小鼠45只，8-10周齡，體重20～25 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002）提供，飼于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)為SYXK（滬）2013-0055）?；旌巷暳蠁位\飼養(yǎng)，自然光照射，室溫控制在20℃左右。本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物征得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。實(shí)驗(yàn)性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后，按Asai J等[2]的方法，用8%硫化鈉脫去后背部區(qū)域的毛發(fā)，溫水清洗拭干。褪毛l天后小鼠行2.5%戊巴比妥鈉按公斤體重40 mg/kg腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后，5%的碘酒及75%的酒精局部消毒術(shù)區(qū)，在小鼠后背部正中用角膜環(huán)鉆剪去一塊直徑為7.5 mm的圓形，全層切除皮膚，開(kāi)放創(chuàng)面，充分止血。待清醒后單籠飼養(yǎng)，按完全隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組，分為基質(zhì)組15只；黃連膏組15只，空白對(duì)照組15只分別做好組間標(biāo)記。創(chuàng)傷模型制成后，從第1天開(kāi)始局部用藥治療，每次換藥時(shí)創(chuàng)面先用碘伏局部消毒清洗后，分別外敷給藥，以填充滿創(chuàng)面為準(zhǔn)，黃連膏組小鼠的創(chuàng)面外敷黃連膏，基質(zhì)組創(chuàng)面外敷基質(zhì)膏，空白對(duì)照組15只用碘伏局部消毒清洗不敷任何藥物，每日兩次，分別于上午8:00時(shí)和下午8:00時(shí)各換藥1次。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 創(chuàng)面觀察及愈合率測(cè)定

于造模后第0、3、7、10、14天，觀察創(chuàng)面大體情況并用數(shù)碼相機(jī)拍照，將創(chuàng)面圖像資料輸入高分辨率計(jì)算機(jī)，跟蹤創(chuàng)面邊緣并計(jì)算出創(chuàng)面區(qū)域。用醫(yī)療專用圖分析軟件Image J予以分析，取得面積數(shù)據(jù)，計(jì)算出創(chuàng)面愈合率[3]。創(chuàng)面閉合的百分率使用下列方程計(jì)算：

創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積一殘余創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×l00%

1.3.2 免疫組織熒光觀察

切片常規(guī)脫蠟和水化，組織抗原修復(fù)，血清封閉，滴加兔多克隆CD-31一抗（稀釋比均為1∶200），4℃孵育過(guò)夜；第二天取出爬片，洗去一抗反應(yīng)液，PBS沖洗3次，滴加單克隆Alexa flour 488標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋比均為1∶1 000），避光孵育30 min，進(jìn)行DAPI核染，每張爬片滴加20 uL抗熒光淬滅封片液，輕覆上蓋玻片，顯微鏡下觀察并采集圖片，圖像輸入計(jì)算機(jī)中，應(yīng)用圖像分析軟件Image J計(jì)算陽(yáng)性染色區(qū)域熒光的強(qiáng)度并量化。

1.3.3 bFGF和PDGF的mRNA水平的檢測(cè)

RT-PCR用來(lái)檢測(cè)不同治療組在不同的時(shí)間（3天、7天、14天）bFGF和PDGF的mRNA水平變化。取創(chuàng)面組織，在液氮冷凍環(huán)境下研磨，加TRIzol 1 ml，照說(shuō)明書(shū)提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA，常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性20 s，55℃退火20 s，75℃延伸50 s，45個(gè)循環(huán)，75℃再延伸8 min。mRNA水平分析采用ΔΔCt方法，引物序列信息由上海華大分子生物技術(shù)研究所合成。

1.3.4 AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達(dá)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。2組各取凍存創(chuàng)面組織0.1 g，加組織裂解液勻漿，提取蛋白并定量。蛋白樣本均以50 μg上樣，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電脈，濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔單克隆AKT（稀釋比均為1∶ 2 000）、pAKTs308、pAKTs437、兔單克隆抗體eNOS一抗、兔多克隆抗體VEGF-A（稀釋比均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。加入山羊抗兔IgG二抗（稀釋比為1∶ 5 000），室溫1小時(shí)振蕩孵育，化學(xué)發(fā)光、顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)行灰度掃描分析，系統(tǒng)自帶軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果以AKT、VEGF、eNos與GAPDH灰度值的比值表示。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本組數(shù)據(jù)采用SPSS 21軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±S）表示，對(duì)CD31計(jì)數(shù)、bFGF和PDGF的mRNA水平等計(jì)量指標(biāo)多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較行Tukey檢驗(yàn)，對(duì)不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面大體觀察及愈合率

傷后0 d，3組小鼠創(chuàng)面均紅腫；傷后3 d，3組小鼠創(chuàng)面痂皮薄、面積較大，無(wú)紅腫，基質(zhì)組小鼠伴有輕度滲出；傷后7 d，3組小鼠創(chuàng)面均干燥，結(jié)痂無(wú)紅腫、滲出。傷后10 d，3組小鼠創(chuàng)面面積明顯縮小，黃連膏組小鼠創(chuàng)面痂皮部分脫落；基質(zhì)組小鼠創(chuàng)面痂皮變厚，部分脫落，創(chuàng)面縮小面積小于同時(shí)相點(diǎn)黃連膏組。空白對(duì)照組創(chuàng)面痂皮變厚，無(wú)脫落，傷后14 d，黃連膏組小鼠大部分創(chuàng)面愈合，創(chuàng)緣周邊較多被毛覆蓋；基質(zhì)組和空白對(duì)照組小鼠創(chuàng)面尚未完全愈合，創(chuàng)緣周邊較少被毛覆蓋。見(jiàn)圖1。

表1 引物序列表

傷后3、7 d小鼠創(chuàng)面愈合率，黃連膏組、基質(zhì)組、空白組對(duì)照組相近（P值均大于0.05）；傷后10、14 d，黃連膏組小鼠創(chuàng)面愈合率顯著高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P值均小于0.01）。3組小鼠傷后7、10、14 d創(chuàng)面愈合率均顯著高于組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)（P值均小于0.01）。見(jiàn)表2。

2.2 對(duì)小鼠創(chuàng)面組織CD-31形成的影響

CD-31是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，因此我們選用CD-31免疫熒光來(lái)標(biāo)記各組小鼠第3、7天創(chuàng)面組織血管生成的影響。結(jié)果顯示黃連膏組傷后3 d創(chuàng)面組織中CD-31陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P＜0.05），傷后7 d，黃連膏組創(chuàng)面組織中CD-31陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P＜0.01）；傷后3、7 d基質(zhì)組和空白對(duì)照組創(chuàng)面組織中CD-31陽(yáng)性細(xì)胞百分率無(wú)差異（P＞0.05）；3小鼠傷后3、7 d創(chuàng)面組織中CD-31陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著高于組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)（P＜0.01或P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖1 3組全層皮膚缺損小鼠各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面大體情況

2.3對(duì)小鼠創(chuàng)面組織bFGF和PDGFmRAN水平的影響

表2 3組全層皮膚缺損小鼠傷后各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較（%，±S）

表2 3組全層皮膚缺損小鼠傷后各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較（%，±S）

注：處理因素主效應(yīng)，F(xiàn)=6.76，P＜0.05；時(shí)間因素主效應(yīng)，F(xiàn)=579.95，P＜0.01；兩者交互作用，F(xiàn)=12.08，P＜0.01；t值、P值為組間同時(shí)相點(diǎn)比較所得，t1值、P1值為黃連膏組與基質(zhì)組相比較；t2值、P2值為黃連膏組與空白組相比較；t3值、P3值基質(zhì)組與空白對(duì)照組相比較；F值、P值為組內(nèi)各時(shí)相點(diǎn)總體比較所得；與組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)比較，aP＜0.01。

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圖2 小鼠創(chuàng)面組織CD-31陽(yáng)性細(xì)胞（第7天，免疫熒光圖×400），綠色熒光代表CD-31陽(yáng)性細(xì)胞

表3 局部應(yīng)用黃連膏對(duì)小鼠創(chuàng)面CD-31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

傷后3、7 d，黃連膏組小鼠創(chuàng)面組織中bFGF的mRAN水平明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P值均小于0.01）；傷后14 d，基質(zhì)組和空白對(duì)照組小鼠創(chuàng)面組織中bFGF的mRAN水平達(dá)到最高，明顯高于黃連膏組（P＜0.05）。黃連膏組小鼠傷后7 d創(chuàng)面組織中bFGF的mRAN水平均顯著高于組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)（P＜0.01），傷后14 d黃連膏組bFGF的mRAN水平低于組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)（P＜0.01），基質(zhì)組和空白對(duì)照組，傷后3、7、14 d創(chuàng)面組織中bFGF的mRAN水平均顯著高于組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)。傷后3、7 d，黃連膏組小鼠創(chuàng)面組織中PDGF的mRAN水平明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05）；3組小鼠傷后3、7 d創(chuàng)面組織中PDGF mRAN水平均顯著高于組內(nèi)前一時(shí)相點(diǎn)（P＜0.01）。傷后14 d，3組小鼠創(chuàng)面組織中PDGF mRAN水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表4和表5。

2.4 對(duì)AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達(dá)影響

結(jié)果顯示黃連膏組傷后7d創(chuàng)面組織中P-AKTS308和P-AKTS437明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），VEGF-A和eNOS的蛋白含量也明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表6及圖3。

表43 組小鼠各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面組織中bFGFmRNA水平比較（x-±S）

表53 組小鼠各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面組織中PDGFmRNA水平比較（x-±S）

表6 黃連膏對(duì)小鼠創(chuàng)面?zhèn)?d創(chuàng)面組織中AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達(dá)影響

3 討論

修復(fù)創(chuàng)面的肉芽組織中含有大量的新生血管，為創(chuàng)面組織的生成提供充分的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此血管的生成是組織修復(fù)的前提和基礎(chǔ)，是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。其中VEGF-A、PDGF和bFGF是最重要的促進(jìn)血管生成的因子。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特定的有絲分裂原，通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖參與支持早期血管生成，對(duì)血管生成起著非常重要的促進(jìn)作用。據(jù)報(bào)道[4]從當(dāng)歸和川芎提取物可影響心肌梗死大鼠VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高雞胚絨毛膜尿囊模型毛細(xì)血管的數(shù)量。同樣，據(jù)研究[5]當(dāng)歸的水提物可以提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、入侵和在人工基底膜基質(zhì)的血管形成以及通過(guò)增強(qiáng)VEGF表達(dá)和刺激p38磷酸化作用促進(jìn)斑馬魚(yú)體內(nèi)血管生成。同時(shí)有報(bào)道[6]生地可以通過(guò)提高VEGF-A的表達(dá)，促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面血管生成。最近的研究報(bào)告指出，生地黃具有促進(jìn)創(chuàng)面血管生成，增強(qiáng)VEGF的表達(dá)[7-8]。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃連膏治療組創(chuàng)面在第3、7天VEGF-A的mRNA表達(dá)明顯高于基質(zhì)組。CD 31是創(chuàng)面微血管組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，因此我們同時(shí)采用免疫熒光檢測(cè)了各組創(chuàng)面CD31陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果表明，第3、7天小鼠創(chuàng)面組織，發(fā)現(xiàn)黃連膏組免疫熒光強(qiáng)度明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組，可見(jiàn)黃連膏中藥能明顯促進(jìn)小鼠創(chuàng)面組織的血管生成。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)傷后7天3組小鼠AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達(dá)

PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其激活后通過(guò)與Akt結(jié)合，促進(jìn)Akt磷酸化，AKT（也稱為蛋白激酶B，PKB）是PI3K下游信號(hào)通路中最為重要的一個(gè)蛋白，其激活需要其2個(gè)重要的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，分別是位于激活結(jié)構(gòu)域的thr308位點(diǎn)和Ser473位點(diǎn)。激活的AKT從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，通過(guò)磷酸化作用磷酸化激活生成NO（nitric oxide，NO）的關(guān)鍵限速酶eNOS（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），從而調(diào)控創(chuàng)面血管生成[9,10]。NO通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和存活在血管生成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[11]。據(jù)報(bào)道[12]姜黃素能夠使內(nèi)皮祖細(xì)胞的eNOS基因表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)了NO分泌，促進(jìn)血管生成。本研究亦顯示，黃連膏治療組傷后7d創(chuàng)面組織eNOS的蛋白含量也明顯高于基質(zhì)組和空白對(duì)照組，并且磷酸化的AKTS308和AKTS437兩個(gè)位點(diǎn)蛋白含量明顯高于基質(zhì)組。

由此可見(jiàn)黃連膏外用可以促進(jìn)全層皮膚切除小鼠創(chuàng)面的愈合速度，促進(jìn)創(chuàng)面毛細(xì)血管的生成，可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路促進(jìn)AKTS308和AKTS437兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化，調(diào)節(jié)eNOS、VEGF-A的蛋白表達(dá)，促進(jìn)PDGF和bFGF的生成有關(guān)。

中藥治療疾病特點(diǎn)是多靶點(diǎn)、多渠道發(fā)揮作用，未來(lái)還應(yīng)進(jìn)一步的從創(chuàng)面愈合的其它方面，如黃連膏與表皮上皮化、與其它生長(zhǎng)因子、及分子、細(xì)胞方面探討黃連膏對(duì)創(chuàng)面的愈合作用。