丁 巖，游麗萍，蔣嘉明，時 楨，楊 昕，何澤慧

（上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心 上海 201203）

心血管疾病是嚴重威脅人類健康的疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球每年死于心血管病的人約占總死亡人數(shù)的近1/6[1]。心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI），是指由于某些原因?qū)е滦呐K組織或細胞缺血或缺氧一段時間，后恢復血流供應的現(xiàn)象，此時細胞或組織不但沒有恢復正常生理功能，反而產(chǎn)生一系列更為嚴重的損傷[2]。MIRI可造成心臟舒縮功能抑制、細胞膜受損、心肌組織壞死等，其機制涉及自由基損傷、細胞凋亡、炎癥反應等因素[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，中藥可以通過降低心肌耗氧量、清除自由基、抗心肌細胞凋亡、促血管新生、調(diào)節(jié)心肌組織中基因的表達等機制起到抗心肌缺血再灌注損傷的作用[5-8]。三七為五加科人參屬植物，是常用的活血化瘀中藥，近年來隨著市場需求的增加，綜合利用三七各部位，充分開發(fā)利用三七具有重要意義。三七莖葉是三七的活性部位，有研究表明其主要活性成分三七莖葉總皂苷（Panax notoginsengsaponins in stems and leaves，PNSSL）對于心血管系統(tǒng)具有與根皂苷相似的生物活性[9]，并具有一定的抗心律失常和抗心絞痛的作用[10-11]，但三七莖葉總皂苷對于在體大鼠缺血再灌注模型的影響尚未見報道[12-13]，且藥物作用的機制研究尚不明確。

本實驗建立在缺血再灌注大鼠心肌損傷模型基礎(chǔ)上，給予三七莖葉總皂苷進行藥物干預，通過檢測心電圖ST段變化，心肌梗死面積，血清中心肌酶LDH、CK、AST、ALT活性，心肌組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量，并通過病理切片觀察組織損傷，綜合評價藥物對于缺血再灌心肌損傷的保護作用，為三七莖葉總皂苷的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重200-250 g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。動物飼養(yǎng)在室溫（22±2）℃，濕度（45%-65%）和明暗交替（12 h∶12 h）環(huán)境中，自由攝食和飲水。實驗操作均嚴格按照實驗動物倫理學相關(guān)規(guī)則進行。

1.2 藥品與試劑

三七莖葉總皂苷來源于云南文山齊丹制藥有限公司，純度80%；地奧心血康膠囊，成都地奧制藥集團有限公司（批號國藥準字Z1091005）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號20170303）、肌酸激酶（CK）測定試劑盒（批號20170302）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測試盒（批號20180120）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試盒（批號20180120）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號20171118）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號20171118）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測定試劑盒（批號20171118），由南京建成生物科技有限公司提供。

1.3 實驗儀器

HX-300S型動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；722N型分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TGL-20000cR型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；RM6240 BD型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

SD雄性大鼠隨機分為6組，即假手術(shù)組、模型組、三七莖葉總皂苷組（40，80，160 mg·kg-1）、地奧心血康組（60 mg·kg-1），以10 mL·kg-1劑量灌胃預防給藥，每天同一時間灌胃一次，共給藥七天，第七天給藥后半個小時進行心肌缺血再灌注模型建立。假手術(shù)組、模型組給予等量的生理鹽水。

2.2 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立

用1%的戊巴比妥鈉50 mg·kg-1進行腹腔注射麻醉大鼠，背部固定，大鼠的四肢皮下連接有心電圖電極，用以記錄標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖。經(jīng)口部插氣管，連接小動物呼吸機，設(shè)置呼吸頻率為60次/min，潮氣量10 mL。于左側(cè)第四肋間開胸，用6/0絲線在肺動脈圓錐和左心耳交界下緣1-2 mm處（左冠狀動脈前降支LAD）進行結(jié)扎，以結(jié)扎部分紫紺和心電圖ST段抬升作為結(jié)扎成功的標志[14-16]。所有動物經(jīng)結(jié)扎冠脈60 min后松扎，再灌注45 min。

2.3 大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖ST段的變化

大鼠麻醉后仰位固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄結(jié)扎前、缺血后及再灌注后各組Ⅱ?qū)?lián)心電圖心電圖，觀察ST段的抬高情況。

2.4 心肌梗死面積

造模后，腹主動脈取血，并迅速取出心臟，置冰冷生理鹽水中沖洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌組織，置于-20℃冰箱放置10 min。從心尖開始，垂直于冠狀面將心臟切成2 mm厚的薄片5片，將切好的心臟移動到1%TTC磷酸鹽緩沖染液的玻璃瓶中。37℃恒溫水浴避光孵育15 min，不斷振蕩使其充分著色。取出后置10%甲醛溶液中固定。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗死區(qū)為白色，高分辨相機拍照后，用Image-Pro-Plus 5.1軟件分析并計算梗死面積，分析梗死區(qū)及整體心肌面積，以梗死區(qū)心肌面積占整體心肌面積的百分比（%）作為衡量梗死范圍的指標。

梗死范圍%=梗死區(qū)心肌面積 整體心肌面積×100%

2.5 血清中心肌酶活性測定

模型建立成功后，腹主動脈取血，將血液靜置約2 h，4℃低溫離心（3 000 r·min-1）15 min,取離心后血清置于離心管中，-80℃儲存待測。取少量血清樣品，按試劑盒說明書進行操作，對不同分組血清中LDH、CK、AST和ALT活性進行測定。

2.6 心肌組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量測定

制備組織樣品勻漿液，適當稀釋，用BCA試劑盒建立標準曲線，確定蛋白濃度。取少量樣品按試劑盒說明書測定組織中SOD、GSH-Px活性以及MDA的含量。

2.7 大鼠心肌組織病理形態(tài)學觀察

取出預保留的心肌組織部分浸泡于甲醛中，固定24小時后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度為6 μm，進行HE染色，光顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)變化。

2.8 統(tǒng)計學處理

用SPSS17.0軟件，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，進行單因素方差分析，進行組間比較，結(jié)果以±s表示，P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖ST段的變化

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠在結(jié)扎后心電圖上ST段抬高明顯，且再灌注后仍升高（P＜0.01），模型建立成功。與模型組相比，當給予PNSSL 80、160 mg·kg-1濃度藥物干預時，大鼠在再灌注后ST段逐漸恢復（P＜0.05），提示三七莖葉總皂苷能夠改善由于缺血引起的心電圖ST段的抬升，見表1。

3.2 心肌梗死面積

假手術(shù)組大鼠心肌組織經(jīng)TTC染色呈現(xiàn)鮮紅色，而模型組與給藥組均呈現(xiàn)出不同程度的蒼白色的梗死區(qū)域，如圖1。結(jié)扎冠狀動脈前降支后，模型組大鼠心肌梗死范圍升高顯著。PNSSL 40，80，160 mg/kg組及地奧心血康組均可降低心肌缺血模型大鼠的心肌梗死范圍，其中給予PNSSL80，160 mg/kg劑量時降低顯著(P＜0.05，P＜0.01)，見表2。

3.3 大鼠血清中心肌酶活性檢測

由表3結(jié)果可見，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中心肌酶活性明顯增加（P＜0.05），提示缺血再灌注大鼠模型對于心肌細胞細胞膜具有一定的損傷作用。當給予藥物PNSSL時，大鼠血清中LDH、CK、AST、ALT活性均降低，其中給予PNSSL80、160mg·kg-1劑量時，CK、AST活性下降顯著（P＜0.05）；PNSSL濃度為160 mg·kg-1時，LDH活性明顯降低（P＜0.05），ALT活性隨PNSSL給藥劑量增加而呈現(xiàn)下降趨勢。

表1 大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖ST段的變化（±s）

表1 大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖ST段的變化（±s）

注：與模型組相比較：**P＜0.01，*P＜0.05。

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3.4 心肌組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量測定

由表4結(jié)果可見，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低（P＜0.05），MDA含量略有升高。當給予藥物PNSSL時，大鼠心肌中SOD、GSH-Px活性升高，其中給予PNSSL80 mg·kg-1劑量SOD、GSH-Px活性升高明顯（P＜0.05），給予PNSSL不同濃度后，MDA含量呈降低趨勢。

3.5 大鼠心肌組織病理形態(tài)學觀察

鏡下觀察大鼠心肌組織切片，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)基本無異常，心肌細胞排列比較整齊，橫紋清楚。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)多處斷裂，間質(zhì)增寬水腫，局部呈現(xiàn)波浪形，可見多處變性壞死灶，胞質(zhì)有溶解現(xiàn)象，程度較重，其結(jié)果見圖2。給予PNSSL后，可見與模型組相比較，PNSSL各組變性壞死灶程度明顯減輕，組織結(jié)構(gòu)得到改善，其中PNSSL 80，160 mg·kg-1組大鼠心肌纖維排列較整齊，間質(zhì)水腫減輕，提示PNSSL能夠降低間質(zhì)細胞浸潤和心肌纖維紊亂，對于缺血再灌注損傷大鼠心肌具有明顯的保護作用。

圖1 大鼠心肌梗死面積

表2 三七莖葉總皂苷對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死范圍的影響（±s）

表2 三七莖葉總皂苷對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死范圍的影響（±s）

注：與模型組相比較：**P＜0.01，*P＜0.05。

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4 討論

心肌缺血再灌注損傷已經(jīng)成為阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題，當恢復供血后會加重由于缺血造成的器官損傷，使可逆性損傷轉(zhuǎn)為不可逆[17-20]，造成心臟舒縮功能抑制、細胞膜受損、心肌組織壞死等現(xiàn)象，這可能與能量代謝障礙、鈣超載、炎性反應以及細胞凋亡等過程有關(guān)[21-22]。有研究表明，PNSSL可提高離體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型下心肌組織中的SOD、GSH-Px活性，改善犬急性心肌梗死引起的血漿ET活性升高，降低血漿中TXB2水平，同時能夠增加心肌血流量，改善心功能，具有一定程度的抗心律失常和抗心絞痛的作用。本實驗通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支60 min再灌注45 min建立心肌缺血再灌注模型，以心電圖ST段變化、心肌梗死范圍、血清及組織中酶活性等作為PNSSL干預作用的評價指標，并結(jié)合病理形態(tài)學觀察大鼠心肌組織，探索PNSSL對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

ST段的抬升作為心肌缺血的重要標志[23]，當心肌缺血60 min再灌注45 min后，模型組大鼠心電圖ST段持續(xù)升高，提示模型對于大鼠心肌的收縮舒張功能具有一定的損傷。實驗結(jié)果顯示，PNSSL給藥各劑量組大鼠心電圖ST段在再灌注后均出現(xiàn)明顯的下降趨勢，提示PNSSL可改善由于缺血造成的心電圖ST段升高，對再灌注后心電圖ST段有明顯的改善作用，具有提升心肌舒縮功能的作用。

心肌缺血再灌注損傷可通過多種因素造成心肌細胞受損和細胞膜通透性的增加，進而使得細胞內(nèi)的標志性心肌酶LDH、CK、AST、ALT隨心肌細胞破裂而釋放出來，造成血清中活性升高。當給予PNSSL干預時，血清中LDH、CK、AST活性明顯降低（P＜0.05），提示PNSSL可提高心肌細胞膜的穩(wěn)定性，減少心肌酶的釋放，避免心肌細胞的損傷。

SOD、GSH-Px是維持機體氧化平衡的重要物質(zhì)，反應的是機體清除氧自由基的能力[24]。缺血再灌注后，模型組大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低，是由于機體長時間處于缺血狀態(tài)后重新恢復供血或供氧，氧氣大量增加而產(chǎn)生過氧化，使得氧自由基大量堆積進而造成組織損傷。實驗中PNSSL組能夠顯著提升組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，提示PNSSL可以提高機體抗氧化的能力，清除氧自由基，起到保護受損心肌的作用。

表3 三七莖葉總皂苷對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中心肌酶活性的影響（±s）

表3 三七莖葉總皂苷對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中心肌酶活性的影響（±s）

注：與模型組相比較：**P＜0.01，*P＜0.05。

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表4 三七莖葉總皂苷對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響（±s）

表4 三七莖葉總皂苷對缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響（±s）

注：與模型組相比較：**P＜0.01，*P＜0.05。

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圖2 大鼠心肌病理切片（HE×400）

心肌梗死范圍的減小和心肌壞死程度的降低是評價藥物對心肌缺血再灌注損傷保護作用的主要指標。實驗中通過檢測心肌梗死范圍發(fā)現(xiàn)，與模型組相比較，PNSSL各劑量組能夠明顯降低心肌組織梗死面積，減少心肌組織損傷；同時心肌組織病理學檢測顯示，模型組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)多處斷裂，間質(zhì)水腫增寬，出現(xiàn)炎細胞浸潤現(xiàn)象，可見多處變性壞死灶。而與