陳藝丹，周 律，王妮華，范 輝,2＊＊，郭 姣

（1.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局高脂血癥“調(diào)肝降脂”重點(diǎn)研究室/脂代謝三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006）

大黃（Rheum officinale Baill.）為蓼科植物大黃的干燥根或者根莖，其歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，功能主治瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃[1]?，F(xiàn)代研究表明，大黃有抗菌、抗腫瘤、抗高脂血癥、降低血壓、健胃、利膽、保肝、強(qiáng)心、消炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[2]。

據(jù)研究[3]，大黃中蒽醌類成分主要有蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚和大黃酸（圖1）。王志旺等[4]對(duì)不同產(chǎn)地大黃的降脂藥效進(jìn)行研究，均可不同程度地改善高脂血癥大鼠血脂代謝、降低血液粘稠度

圖1 大黃中蒽醌類化合物Fig.1 rhubarb anthraquinones

并提高抗氧化作用。其中大黃酸具有抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種藥理活性，并且在治療糖尿病腎病等疾病及協(xié)同抗腫瘤方面表現(xiàn)突出，成為研究的熱點(diǎn)[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，大黃酸改善脂肪肝疾病可以進(jìn)行負(fù)能量平衡和肝脂肪生成的調(diào)節(jié),這一發(fā)現(xiàn)拓展了大黃酸的藥理作用。本課題聯(lián)合體外肝細(xì)胞脂肪變性模型和親和色譜法，以大黃提取液為研究對(duì)象，篩選大黃蒽醌類調(diào)脂活性成分，尋找大黃酸降脂的科學(xué)證據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Waters Alliance2695高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，色譜柱：DIONEX Acclaim120（5 μm，4.6×250 mm）；Agilent 1290 InfinityⅡ液相系統(tǒng)聯(lián)用Agilent 6545 QTOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1×150 mm，1.7 μm）；SW-CF-1FD超凈臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Mithras LB 940酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（德國Berthold Technologies公司）；5180R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；0.22 μm溶劑過濾器（北京津騰儀器廠）；杯式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物股份有限公司，Scientz98）；HGC-24A氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；KQ5200E型臺(tái)式機(jī)械超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；PURELAB Ultra GE MK2純水儀（ELGA,High Wycombe,UK）；BT224s型萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑

大黃（批號(hào)160101）購自于廣州市誠濟(jì)藥業(yè)有限公司；蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)X0550050）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)G1110010）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)G1270010）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)F1390025）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)H5310010）均購自于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；DMSO購自于美國Sigma公司；色譜純甲醇（美國Honeywell公司&德國Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其余試劑為分析純，購自于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

高糖DMEM培養(yǎng)基購自于美國GIBCO公司（批號(hào)129007）；胰酶購自于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司（批號(hào)89010440）；血清購自于賽默飛世爾；油酸鈉、棕櫚酸鈉購自于美國Sigma公司；三酰甘油（TG）試劑盒購自于南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品、供試品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液配制

取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加DMSO溶解并用甲醇稀釋定容至1.0 mL，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液配制

稱取大黃粉末（過四號(hào)篩）適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入適量甲醇，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，在稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液適量，超聲處理2 min，再加適量三氯甲烷，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，分取三氯甲烷，酸液再用三氯甲烷提取3次，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%FBS的DEME培養(yǎng)液，將HepG2人肝癌細(xì)胞株放置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約80%，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代，每2-3天傳代一次。

2.3 大黃蒽醌類成分降脂活性試驗(yàn)

調(diào)整HepG2細(xì)胞懸液濃度，以每孔2×105的細(xì)胞個(gè)數(shù)接種于6孔板，正常培養(yǎng)48 h，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，分組給藥：正常對(duì)照組給予含10%FBS的完全培養(yǎng)基、模型組給予0.5 mmol·L-1FFA培養(yǎng)基（油酸鈉/棕櫚酸鈉，2:1，0.5 mmol·L-1）、給藥組給予含不同濃度大黃（25.0，50.0，100.0 μg·mL-1）以及不同濃度蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（1.0，5.0，25.0 μg·mL-1）的0.5 mmol·L-1FFA培養(yǎng)基，每組做6個(gè)平行孔。

24 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗滌1-2遍，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，將各孔細(xì)胞懸液平均分成兩份（細(xì)胞A和細(xì)胞B），4℃ PBS洗滌細(xì)胞兩次，4℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞A管加入100 μL異丙醇，細(xì)胞B管中加入100 μLPBS，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞，再以4℃，1 3500 r/min離心10 min，收集A和B管上清液，用三酰甘油（TG）試劑盒測(cè)定細(xì)胞A管上清中TG含量，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞B管中蛋白含量，換算成TG/蛋白含量的比值。

2.4 高效液相色譜法

2.4.1 色譜條件

色譜柱：DIONEX Acclaim120（5 μm，4.6×250 mm）用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15），等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于3000；在此色譜條件下大黃蒽醌類中各成分可以完全分離。

2.5 液質(zhì)聯(lián)用LC-Q-TOF-MS法

2.5.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1x150 mm，1.7 μm），流動(dòng)相0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 min，40%B；0～3 min，40%～100%B；3～5 min，100%B；5～5.1 min，100%～40%B；5.1～8 min，40%B），流速0.3 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件

Agilent 6545 LC-Q-TOF-MS液質(zhì)分析系統(tǒng)，ESI離子源，負(fù)離子模式，全掃描一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍為100-1500 m/z，霧化氣壓力35 psi，干燥氣流速8 L·min-1，干燥氣溫度320℃，毛細(xì)管電壓3 500 V。

2.6 大黃蒽醌類與HepG2肝癌細(xì)胞株特異性結(jié)合試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞（即將長滿）6皿，PBS液洗滌2遍，除去細(xì)胞代謝物；3皿加入不含藥DMEM培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，另3皿加入100 μg·mL-1大黃蒽醌類溶液，8 mL/皿，37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。24 h后，細(xì)胞形態(tài)良好，收集上清液，過0.22 μm濾膜，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，PBS液洗滌2遍，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。

用5 mLPBS液/次洗滌細(xì)胞，離心1 000 r/min×5 min，共洗滌5次，留末次洗滌液，過0.22 μm濾膜，所得濾液按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。

將收集得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入1 mL75%乙醇吹打均勻，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞，高速離心（10 000 r/min×l0 min），取上清液，氮?dú)獯蹈桑?.5 mL甲醇復(fù)溶，高速離心（10 000 r/min×l0 min），取上清液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析。

2.7 大黃酸、大黃素對(duì)照品與HepG2肝癌細(xì)胞株特異性結(jié)合試驗(yàn)

空白組、100 μM大黃酸組和100 μM大黃素組，各平行3份，按2.6項(xiàng)進(jìn)行特異性結(jié)合試驗(yàn)，按2.5項(xiàng)下條件進(jìn)行液質(zhì)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大黃蒽醌類成分降脂活性驗(yàn)證試驗(yàn)

不同濃度的大黃提取液（12.5，25.0，50.0，100.0 μg·mL-1），不同濃度蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（0.2，1.0，5.0，25.0 μg·mL-1）與FFA共同作用于HepG2細(xì)胞24 h。在不同濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)TG含量隨濃度的增加呈劑量依賴性減少，與模型組比較，各給藥組均有顯著性差異（P＜0.05）（圖2），且呈劑量依賴性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1 大黃蒽醌類成分與HepG2細(xì)胞株的特異性結(jié)合的HPLC分析

采用HPLC法分別分析大黃原液、大黃加藥培養(yǎng)基、大黃作用后的HepG2細(xì)胞提取液、最后一次洗脫液和空白對(duì)照，在254 nm檢測(cè)波長處，通過比較大黃作用細(xì)胞提取液和大黃原液，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞提取液中大黃與細(xì)胞特異性結(jié)合成分主要有4個(gè)，分別為蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚四個(gè)化合物，而大黃酸未檢測(cè)到。在254 nm檢測(cè)波長下，空白對(duì)照和最后一次洗脫液并無響應(yīng)，證明方法專屬性較好，在最后一次洗滌細(xì)胞的洗脫液中已無任何可積分成分，說明已排除非特異性結(jié)合成分的影響（圖3）。

3.2 大黃酸和大黃素成分與HepG2細(xì)胞株的特異性結(jié)合的液質(zhì)分析

采用液質(zhì)聯(lián)用方法分析大黃酸和大黃素成分與HepG2細(xì)胞株的特異性結(jié)合，大黃酸和大黃素的檢測(cè)離子對(duì)分別是283.0/239.0，269.0/225.0 m/z（圖4B、圖4C）。通過LC-MS全掃描分析大黃酸和大黃素的對(duì)照品、細(xì)胞上清以及細(xì)胞提取液，發(fā)現(xiàn)大黃素細(xì)胞給藥后的細(xì)胞提取液中含有大黃素，而大黃酸細(xì)胞給藥后細(xì)胞提取液中沒有大黃酸，但發(fā)現(xiàn)含有269.0 m/z的碎片離子（圖4A），與標(biāo)準(zhǔn)品比較，發(fā)現(xiàn)不是大黃素，可能是蘆薈大黃素。

4 討論

本研究采用HepG2細(xì)胞系，以游離脂肪酸（油酸鈉/棕櫚酸鈉，2∶1，0.5 mmol·L-1）誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型評(píng)價(jià)大黃五種蒽醌類成分的降脂效應(yīng)[8]。模型組三酰甘油含量較正常組的高5倍，成功建立體外肝細(xì)胞脂肪變性模型。大黃及五種蒽醌類成分均具有顯著體外降脂活性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-11]。

圖2 大黃提取液（A）、蘆薈大黃素（B）、大黃酸（C）、大黃素（D）、大黃酚（E）和大黃素甲醚（F）對(duì)肝細(xì)胞三酰甘油蓄積的影響Fig.2 The effect of rhubarb(A),aloe-emodin(B),rhein(C),emodin(D),chrysophanol(E)and physcion(F)on TG accumulation in HepG2 cells

本實(shí)驗(yàn)室已建立肝細(xì)胞親和色譜法用于篩選肝細(xì)胞為靶細(xì)胞的調(diào)脂中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[8,12]，利用該模型對(duì)大黃蒽醌類成分進(jìn)行親和篩選。結(jié)果表明，與大黃原液、標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和光譜特征比較，細(xì)胞親和液中檢測(cè)到四種肝細(xì)胞特異性親和成分，分別為蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，未檢測(cè)出大黃酸。因大黃酸體外降脂活性顯著，分析大黃酸的降脂途徑可能與其他蒽醌類成分不同。

為了觀察大黃酸的體外細(xì)胞作用特點(diǎn)，采用高靈敏度和高分辨率的LC-Q-TOF-MS進(jìn)行分析，以大黃酸和大黃素標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞給藥后分別驗(yàn)證，液質(zhì)中檢測(cè)離子對(duì)分別是大黃酸283.0/239.0和大黃素的269.0/225.0 m/z，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞親和液中能檢測(cè)到大黃素（269.0/225.0 m/z），表明大黃素可能是原型形式與細(xì)胞親和。而大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞親和液中大黃酸（283.0/239.0 m/z）仍未檢出。但檢測(cè)到離子碎片（269.0 m/z），因?yàn)殡x子碎片（269.0 m/z）與大黃素和蘆薈大黃素一致，通過與大黃素標(biāo)準(zhǔn)品和蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較，判斷不是大黃素，可能為蘆薈大黃素（圖4A）。另外，根據(jù)結(jié)構(gòu)比對(duì)，大黃酸與蘆薈大黃素均為蒽醌母核上3位取代基分別為-COOH和-CH2OH，而大黃素為6位甲基取代，3位OH取代（圖1）。綜上化學(xué)結(jié)構(gòu)推測(cè)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，大黃酸可能存在體外細(xì)胞代謝，經(jīng)Ⅰ相還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化成蘆薈大黃素。

圖3 大黃蒽醌類成分與HepG2細(xì)胞特異性結(jié)合HPLC圖Fig.3 Chromatograms of rhubarb anthraquinones treated with HepG2 cells

圖4 大黃素和大黃酸LC-MS圖Fig.4 Chromatograms of emodin and rhein

目前報(bào)道的大黃酸的代謝途徑及產(chǎn)物主要是葡萄糖醛酸化，硫酸酯化，甲基化。我們首次在細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)大黃酸可能具有細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為蘆薈大黃素的細(xì)胞親和代謝行為。大黃酸單體細(xì)胞給藥24 h后肝細(xì)胞親和液中未檢測(cè)到大黃酸，但具有顯著體外降脂效應(yīng)，可能的原因是大黃酸轉(zhuǎn)化為蘆薈大黃素繼續(xù)發(fā)揮著降脂效應(yīng)。

總之，本研究通過肝細(xì)胞脂肪變性模型聯(lián)合肝細(xì)胞親和色譜法篩選和評(píng)價(jià)大黃蒽醌類肝細(xì)胞降脂活性成分，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚以原型的形式體外肝細(xì)胞降脂，而大黃酸可能以體外細(xì)胞代謝為蘆薈大黃素形式降脂，本研究為中藥活性成分篩選提供思路，為大黃蒽醌類調(diào)脂藥物開發(fā)提供證據(jù)。