吳立飛，來志超，李天佳，王子軍，邵 磊，劉 暴

1北京市房山區(qū)第一醫(yī)院心血管外科，北京 1024002中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 100730

頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)(carotid endarterectomy，CEA)已被證實能有效治療頸動脈狹窄和預(yù)防腦卒中的發(fā)生，但CEA本身可引起嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥卒中和死亡，2017年1篇Meta分析中，3064例CEA患者中有100例出現(xiàn)圍手術(shù)期卒中或死亡事件，其發(fā)生率為3.3%[1]。而CEA術(shù)中由于動脈粥樣硬化斑塊自發(fā)性破裂或手術(shù)操作不當(dāng)致微栓子脫落所導(dǎo)致的腦缺血性損傷是引起CEA術(shù)后卒中和死亡的主要原因之一。另外，微栓子脫落造成的局部腦組織灌注不足還可引起認(rèn)知功能下降等亞臨床癥狀[2]。目前，對于CEA術(shù)后出現(xiàn)的腦缺血性損傷，缺乏快速有效的診斷方法，臨床上也需要有效的預(yù)警方法以便早期發(fā)現(xiàn)CEA相關(guān)的腦缺血性損傷?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)- 9是一種鋅和鈣依賴的內(nèi)肽酶，可降解膠原Ⅳ和膠原Ⅴ，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞復(fù)制、組織重建中發(fā)揮分解細(xì)胞外基質(zhì)作用，MMP- 9同樣參與炎癥和腫瘤轉(zhuǎn)移等病理活動，尤其與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。有研究表明，MMP- 9在卒中發(fā)生后表達升高[3- 5]，其可能是腦缺血性損傷的一種有效生化標(biāo)志物。CEA圍手術(shù)期腦缺血性事件的發(fā)生同卒中發(fā)生有共同的機制，但目前尚無研究對MMP- 9在CEA圍手術(shù)期的動態(tài)表達以及MMP- 9和 CEA術(shù)后腦缺血性損傷的關(guān)系做相關(guān)探討。因此，本研究前瞻性探討MMP- 9在CEA患者中的表達變化情況及其臨床預(yù)警作用。

對象和方法

對象選取2012年2至9月在北京協(xié)和醫(yī)院血管外科行CEA治療的頸動脈狹窄患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：同意參與本研究并簽署知情同意書；年齡40～80歲；術(shù)側(cè)頸動脈狹窄≥70%；術(shù)前60 d內(nèi)未發(fā)生腦血管事件；經(jīng)顱多普勒超聲(transcranial doppler，TCD)監(jiān)測存在顳窗；術(shù)前已行頸動脈CT血管造影證實狹窄程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：拒絕簽署知情同意書；無顳窗，不能在CEA術(shù)中監(jiān)測微栓子脫落情況；頸動脈支架置入術(shù)后再狹窄；非動脈粥樣硬化性頸動脈狹窄，如大動脈炎、纖維肌性發(fā)育不良；對抗血小板和他汀類藥物過敏。

臨床資料共納入40例患者，收集患者的一般情況、病史等資料，包括年齡、性別、高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血癥、短暫腦缺血發(fā)作(transient ischemia attacks，TIA)發(fā)作史、卒中發(fā)作史等。根據(jù)術(shù)中TCD監(jiān)測，8例術(shù)中監(jiān)測到微栓子脫落者納入栓子組，32例未監(jiān)測到微栓子脫落者納入無栓子組。

手術(shù)步驟所有CEA均在全麻下進行，并以TCD持續(xù)監(jiān)測術(shù)側(cè)微栓子脫落情況。頸動脈完全暴露后，普通肝素80～100 IU/kg入壺。另外，在頸動脈夾閉之前，在入室血壓的基礎(chǔ)上將血壓提升20%，以提高對側(cè)頸動脈的代償作用，保證患側(cè)頸動脈夾閉期間腦組織血供。根據(jù)術(shù)中情況，16例采用經(jīng)典CEA術(shù)式，即縱行切開頸總動脈及頸內(nèi)動脈進行斑塊剝除，其中2例使用轉(zhuǎn)流管；24例采用翻轉(zhuǎn)式CEA術(shù)式，即環(huán)形切開頸內(nèi)動脈起始部進行斑塊剝除。

血清檢測在CEA術(shù)前(入室后，麻醉開始前)、頸動脈開放前、開放后30 min、術(shù)后12 h分別采集大隱靜脈血5 ml，均使用促凝管。采集成功后室溫靜置1 h，613 ×g 離心10 min，抽取上清并分裝至離心管，分裝完成后立即置于-80℃冰箱保存并避免反復(fù)凍融。血清MMP- 9濃度使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)進行檢測，ELISA試劑盒(Beijing 4A Biotech Co. Ltd.，Beijing)所有樣本均設(shè)3個復(fù)孔，試劑盒檢測靈敏度為30 pg/ml，板間及板內(nèi)檢測變異系數(shù)均<10%。血清MMP- 9活性使用明膠酶譜試劑盒進行檢測(Life Technologies，USA)，以MMP- 2為內(nèi)參，上樣量為未經(jīng)稀釋血清1 μl/孔。MMP- 9濃度及活性檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間定量資料比較使用t檢驗，定性資料采用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況共納入40例患者，栓子組8例(共監(jiān)測到27個微栓子脫落，均在夾閉頸動脈期間出現(xiàn))，非栓子組32例，兩組患者在年齡、性別、糖尿病、高血壓、冠心病、高脂血癥、TIA發(fā)作史、卒中發(fā)作史、術(shù)式方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。至術(shù)后30 d，所有患者均未出現(xiàn)術(shù)后卒中或TIA發(fā)作。

血清檢測CEA術(shù)前、開放前、開放后30 min、術(shù)后12 h 4個時間點MMP- 9濃度分別為(367.44±182.15) ng/ml、(213.69±169.42) ng/ml、(254.51±207.65) ng/ml、(559.05±336.94) ng/ml。在術(shù)前、開放前、開放后30 min 3個時間點，MMP- 9在無栓子組和栓子組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而術(shù)后12 h，MMP- 9在栓子組的濃度顯著高于無栓子組(t=-3.741，P=0.001)(表2)。在無栓子組，術(shù)前、術(shù)后12 h MMP- 9的血清濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.643，P=0.081)；而在栓子組，術(shù)后MMP- 9的血清濃度較術(shù)前明顯升高(t=4.132，P=0.001)。

此外，所有血清標(biāo)本均使用明膠酶譜法對MMP- 9活性進行檢測，檢測結(jié)果同ELISA結(jié)果一致，在無栓子組，術(shù)前和術(shù)后12 h MMP- 9活性無變化，而在栓子組，MMP- 9活性在術(shù)后12 h明顯升高(圖1)。

表 1 兩組一般資料比較Table 1 Comparisons of the general information between two groups

TIA：短暫腦缺血發(fā)作；CEA：頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)

TIA：transient ischemia attacks；CEA：carotid endarterectomy

表 2 兩組不同時間點患者MMP- 9濃度比較(-±s，ng/ml)Table 2 Comparisons of the MMP- 9 concentration at different time points between two groups(-±s，ng/ml)

MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶；和術(shù)前比較，at=4.132，aP=0.001

MMP：matrix metalloproteinases;at=4.132，aP=0.001 compared with preoperative

Emboli(-)：無栓子組；Emboli(+)：栓子組；Pre-op：術(shù)前；12 h Post-op：術(shù)后12 h

Emboli(-)：embolic-negative group；Emboli(+)：embolic-positive group；Pre-op：preoperative；12 h Post-op：12 hours post-operative

圖1栓子組和無栓子組術(shù)前和術(shù)后12 h MMP- 9活性

Fig1Preoperative and 12 hours postoperative MMP- 9 activity in the embolic-positive group and the embolic-negative group

討 論

動脈粥樣硬化斑塊由膽固醇結(jié)晶、鈣化灶、脂質(zhì)核以及纖維帽等構(gòu)成，在CEA手術(shù)過程中，可由于斑塊自發(fā)性破裂或手術(shù)操作原因而發(fā)生微栓子脫落，引起顱內(nèi)動脈栓塞和腦組織局部灌注不足，導(dǎo)致CEA相關(guān)的腦缺血性損傷，包括無癥狀腦梗灶、卒中甚至死亡事件的發(fā)生。有研究顯示近期發(fā)生卒中或TIA的患者中，有25%的患者監(jiān)測到自發(fā)性微栓子脫落，這部分患者中又有23%的患者再次發(fā)生卒中或TIA，證實微栓子脫落同腦缺血性損傷關(guān)系密切[6]。不過，目前對于CEA圍手術(shù)期腦缺血性損傷的診斷主要依據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)檢查，如CT和磁共振成像，但這些影像學(xué)檢查并不能在早期有效地發(fā)現(xiàn)腦缺血性損傷，盡管有研究顯示CT可在急性腦梗死發(fā)病6 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)腦組織中缺血半暗帶，但其技術(shù)相對復(fù)雜且難以普遍應(yīng)用[7]。對于未導(dǎo)致明顯臨床癥狀的微栓子脫落，更是只能通過術(shù)中TCD監(jiān)測發(fā)現(xiàn)。因此，臨床上迫切需要能對CEA術(shù)后腦缺血性損傷進行及時和準(zhǔn)確診斷的方法，為術(shù)后治療方案制定及護理級別選擇提供依據(jù)。

MMP- 9是一種鋅離子依賴蛋白酶，它在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。臨床和動物實驗表明，卒中發(fā)生后MMP- 9表達升高[3- 5]，而MMP- 9抑制劑則可降低腦缺血性損傷的程度和范圍[4]，提示MMP- 9可能是腦缺血性損傷的一種生化標(biāo)志物。然而，在CEA圍手術(shù)期，并不了解MMP- 9的動態(tài)表達情況，以及MMP- 9變化同 CEA相關(guān)性腦缺血性損傷的關(guān)系。本研究觀察CEA圍手術(shù)期MMP- 9動態(tài)變化及其同大腦中動脈血流速度變化、微栓子脫落的關(guān)系，探索MMP- 9在預(yù)警CEA圍手術(shù)期腦缺血性損傷中的作用。本研究顯示在CEA術(shù)中監(jiān)測到微栓子脫落的情況下，MMP- 9表達在CEA術(shù)后12 h明顯高于術(shù)前，而在無微栓子脫落情況下，術(shù)后12 h的MMP- 9表達同術(shù)前相比無變化。另外，通過ELISA和明膠酶譜法分別對MMP- 9濃度和活性進行檢測，得到了完全一致的結(jié)果，保證了結(jié)果的可靠性。

本研究MMP- 9濃度在開放前和開放后30 min相較于術(shù)前出現(xiàn)了明顯降低。如前所述，本研究所有患者均使用了丙泊酚和七氟醚進行麻醉誘導(dǎo)和麻醉維持，臨床研究已證實，丙泊酚和七氟醚可抑制MMP- 9表達，且在全身麻醉過程中具有腦保護作用[9- 12]。因此，筆者考慮術(shù)中MMP- 9濃度降低同丙泊酚、七氟醚等應(yīng)用有關(guān)。由于麻醉藥品種類及劑量、麻醉時間在不同患者存在差異，本研究未能就MMP- 9表達與麻醉藥品的相關(guān)性進行探討。

MMP- 9可有效降解細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅳ型膠原[8]，這決定了其在降低斑塊穩(wěn)定性及血腦屏障破壞方面可發(fā)揮關(guān)鍵作用[3，13- 15]。2017年Zhong等[5]研究顯示，在3186例急性卒中患者中，MMP- 9升高同急性卒中發(fā)生后3個月內(nèi)的死亡、致殘率相關(guān)，提示MMP- 9在腦缺血性損傷中發(fā)揮重要作用，并且和預(yù)后相關(guān)。在動物實驗中，發(fā)現(xiàn)MMP- 9在大鼠大腦中動脈阻塞后4 h即出現(xiàn)升高，并且和血腦屏障破壞緊密相關(guān)[3]，臨床實驗方面，Montaner等[16]對110例卒中發(fā)生后12 h內(nèi)入院的患者進行研究，發(fā)現(xiàn)卒中患者血漿MMP- 9表達明顯高于對照組，并且和卒中后腦梗死體積相關(guān)，提示MMP- 9于卒中后早期即可出現(xiàn)。MMP- 9在腦缺血性損傷早期即可出現(xiàn)，且同腦缺血性損傷嚴(yán)重程度以及預(yù)后相關(guān)，因而可能是腦缺血性損傷一種有效的生化標(biāo)志物。Turner 和Sharp[17]根據(jù)以往多項研究提出假說，MMP- 9在卒中發(fā)生后12～48 h由腦缺血灶內(nèi)中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌，并且是早期血腦屏障破壞的重要原因，但MMP- 9在隨后的腦組織修復(fù)和重塑中同樣發(fā)揮重要作用，因而，通過調(diào)節(jié)MMP- 9及其抑制劑水平有可能是未來治療卒中的一個重要方向。

此前，Molloy等[18]研究顯示MMP- 9 在CEA術(shù)后48 h出現(xiàn)升高且同術(shù)中微栓子脫落有關(guān)，提出術(shù)后48 h MMP- 9表達升高同微栓子脫落造成的腦損傷有關(guān)。不足的是，其研究未能對CEA圍手術(shù)期MMP- 9的活性變化和升高時間進行說明，而本研究證實MMP- 9表達可于CEA術(shù)后12 h內(nèi)升高，且同術(shù)中微栓子脫落有關(guān)，證實MMP- 9有早期發(fā)現(xiàn)CEA術(shù)后微栓子相關(guān)性腦缺血性損傷的作用。

綜上，本研究顯示CEA術(shù)中微栓子脫落可導(dǎo)致術(shù)后12 h MMP- 9升高，因而MMP- 9可能對于隱匿性卒中具有一定的提示作用，對于出現(xiàn)術(shù)后MMP- 9升高的患者，可對其進行更為嚴(yán)密的術(shù)后觀察和更為完善的術(shù)后檢查。