陳 蕓，羅 至，曾 韡，賴(lài)飛呀，陳秋宏，呂 湛，宋永硯

川北醫(yī)學(xué)院 1附屬醫(yī)院心內(nèi)科 2臨床醫(yī)學(xué)系 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，四川南充 637000

隨著我國(guó)人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加劇，心血管病發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加。根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2016》概要，我國(guó)心血管病現(xiàn)患人數(shù)約2.9億，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位[1]。心血管病負(fù)擔(dān)日漸加重，已成為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。心血管病包括冠心病(coronary heart disease，CHD)、腦卒中和外周血管疾病等，其病理學(xué)基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。AS主要由血漿脂質(zhì)成分伴隨炎性細(xì)胞緩慢沉積于血管內(nèi)壁所致。CHD的危險(xiǎn)因素包括高血壓、糖尿病、高脂血癥、超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、高尿酸血癥和高同型半胱氨酸血癥等。相關(guān)基因變異是導(dǎo)致CHD危險(xiǎn)因素聚集的主要原因，除此之外，體力活動(dòng)減少、高脂高熱量膳食和社會(huì)心理因素也是導(dǎo)致CHD危險(xiǎn)因素增加的重要原因。微小RNA(microRNA，miR)- 143/145(miR- 143和miR- 145)基因位于人類(lèi)5號(hào)染色體上，因兩個(gè)微小基因彼此靠近被認(rèn)為是在同一啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的。miR- 143和miR- 145基因表達(dá)與CHD密切相關(guān)[2- 4]。Du等[3]報(bào)道早發(fā)性CHD患者血清中miR- 145水平較年齡和性別匹配的健康對(duì)照者顯著降低。在CHD患者中，Yu等[4]發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后再狹窄組血清中miR- 143水平較無(wú)再狹窄組顯著降低。在miR- 143/145基因的啟動(dòng)子區(qū)存在兩個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)rs353292和rs4705343。幾項(xiàng)病例-對(duì)照研究顯示這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與結(jié)腸癌[5]、宮頸癌[6]和缺血性腦卒中[7]的發(fā)生顯著相關(guān)，但這兩個(gè)位點(diǎn)是否也與CHD的危險(xiǎn)因素及嚴(yán)重程度相關(guān)報(bào)道較少。本研究在我國(guó)漢族人群中，分析rs353292和rs4705343位點(diǎn)與CHD的危險(xiǎn)因素及嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為CHD的基因診斷和基因治療提供理論基礎(chǔ)。

對(duì)象和方法

對(duì)象選取2014年4月至2015年10月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診或住院治療的無(wú)血緣關(guān)系的漢族人群。經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為CHD的患者380例，其中男性236例，平均年齡(60.0±9.6)歲；女性144例，平均年齡(64.3±8.1)歲。經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影診斷為非CHD的對(duì)照者163例，其中男性90例，平均年齡(59.5±12.7)歲；女性73例，平均年齡(58.7±10.2)歲。

臨床資料收集通過(guò)生理生化檢查，獲得高血壓、糖尿病、體質(zhì)量指數(shù)、三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、hs-CRP、尿酸和同型半胱氨酸等反映心血管病危險(xiǎn)因素的指標(biāo)。

CHD診斷及嚴(yán)重程度分型CHD組及對(duì)照組所有成員均接受冠狀動(dòng)脈造影檢查。CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：至少有1支冠狀動(dòng)脈或其主要分支的管腔狹窄程度在50%以上者診斷為CHD。對(duì)照者的診斷標(biāo)準(zhǔn)：正常冠狀動(dòng)脈或輕微狹窄者(小于50%狹窄)，同時(shí)排除無(wú)狀性心肌缺血、血管痙攣性心絞痛、心電圖動(dòng)態(tài)或負(fù)荷試驗(yàn)有ST段壓低、T波倒置等患者。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的心內(nèi)科醫(yī)生在對(duì)受試者病史和生理生化指標(biāo)不知情的情況下行冠脈造影術(shù)。按Judkins法進(jìn)行，在左冠脈系統(tǒng)設(shè)定至少4個(gè)觀測(cè)點(diǎn)，右冠狀動(dòng)脈至少2個(gè)觀測(cè)點(diǎn)。冠脈造影使用荷蘭飛利浦的數(shù)字減影血管造影X線(xiàn)機(jī)(Allura Xper FD10)。CHD患者按嚴(yán)重程度分為心絞痛組和心肌梗死組，穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的診斷采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)制定的相關(guān)指南[8- 10]進(jìn)行。

miR-143/145基因rs353292和rs4705343多態(tài)性分型基因組DNA從外周血白細(xì)胞中提取，采用TIANGEN公司的血液基因組提取試劑盒，操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增含有miR- 143/145基因rs353292和rs4705343多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，上游和下游引物各1 μl，2×PCR TaqMix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。rs353292位點(diǎn)的正向引物為5’-CTTTCTTCTGCCACTCCTCCT- 3’，反向引物為5’-GAAGGGCTTCAGAATTCCG- 3’；rs4705343位點(diǎn)的正向引物為5’-TCCATGTATTGAAATATCCAGAAAGTA- 3’，反向引物為5’-TGTGCAAACAATGGCACAAT- 3’。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56.5℃(rs353292)或60.0℃(rs4705343)40 s，72℃ 60 s，循環(huán)35次；72℃ 5 min。酶切反應(yīng)體系(10 μl)：PCR產(chǎn)物3 μl，BslI(rs353292)或AccI(rs4705343)內(nèi)切酶1.5 U，10×NEB緩沖液1 μl，ddH2O補(bǔ)至10 μl。37℃酶切過(guò)夜，2.5%瓊脂糖凝膠電泳和GoldViewⅠ型核酸染色劑-紫外顯色鑒定基因型。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)性變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料(如TG)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后納入統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)比較CHD患者與對(duì)照者之間、不同基因型者之間各種計(jì)數(shù)指標(biāo)的差異。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較CHD患者與對(duì)照者之間、不同基因型者之間各種計(jì)量指標(biāo)的差異，兩兩比較用LSD法，組內(nèi)多重兩兩比較時(shí)作Bonferroni校正。采用χ2檢驗(yàn)比較rs353292位點(diǎn)不同基因型者之間心絞痛和心肌梗死發(fā)生率的差異。通過(guò)檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡，評(píng)價(jià)樣本的代表性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床資料CHD組年齡(F=28.54，P<0.001)、患高血壓的比例(χ2=12.72，P<0.001)、患糖尿病的比例(χ2=4.71，P=0.03)、TG(F=7.41，P=0.01)、總膽固醇(F=4.00，P=0.05)、載脂蛋白(apolipoprotein，APO)B100(F=7.70，P<0.01)、脂蛋白(a)(F=4.29，P=0.04)、血糖(F=4.14，P=0.04)和hs-CRP(F=9.11，P<0.01)水平顯著高于對(duì)照組，HDL-C(F=8.39，P<0.01)和APO AI(F=9.76，P<0.01)水平顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)、LDL-C、VLDL-C、尿酸和同型半胱氨酸水平兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

基因型及等位基因分布頻率rs353292和rs4705343位于miR- 143/145基因的啟動(dòng)子區(qū)，含有rs353292位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為140 bp；含有rs4705343位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為147 bp。rs353292位點(diǎn)由胞嘧啶(C)變異成胸腺嘧啶(T)生成，變異后限制酶BslI的識(shí)別序列(5’-CCNNNNN↓NNGG- 3’)和切割位點(diǎn)消失。在酶切后的電泳圖譜上，TT基因型僅含有140 bp的1個(gè)片段；CT基因型含有140、120和20 bp的3個(gè)片段；CC基因型含有120和20 bp的兩個(gè)片段。在電泳圖譜上，20 bp的DNA片段因太小而檢測(cè)不到(圖1A)。rs4705343位點(diǎn)由T變異成C生成，變異后產(chǎn)生限制酶AccI的識(shí)別序列(5’-GT↓MKAC- 3’)和切割位點(diǎn)。在酶切后的電泳圖譜上，TT基因型僅含有147 bp的1個(gè)片段；CT基因型含有147、121和26 bp的3個(gè)片段；CC基因型含有121和26 bp的兩個(gè)片段。在電泳圖譜上，26 bp的DNA片段因太小而檢測(cè)不到(圖1B)。miR- 143/145基因rs353292和rs4705343位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在CHD組與對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表2)。CHD組(χ2=27.89，P<0.05)和對(duì)照組(χ2=11.65，P<0.05)中rs353292位點(diǎn)基因型的分布頻率的比較顯示，變異純合子(TT)比例增高，雜合子(CT)比例減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但尚未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡。CHD組(χ2=47.19，P<0.05)和對(duì)照組(χ2=9.33，P<0.05)中rs4705343位點(diǎn)基因型的分布頻率的比較顯示，變異純合子(CC)比例減低，雜合子(CT)比例增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但尚未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡。

表 1 研究人群的臨床特征Table 1 Clinical characteristics of the study population

CHD：冠心?。籐DL-C：低密度脂蛋白膽固醇；VLDL-C：極低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；hs-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白

CHD： coronary heart disease；LDL-C： low-density lipoprotein cholesterol；VLDL-C： very low-density lipoprotein cholesterol；HDL-C： high-density lipoprotein cholesterol；hs-CRP： hypersensitive C-reactive protein

M：DNA分子量標(biāo)記；A：rs353292位點(diǎn)：1、2、3、4、5和8泳道為CC基因型，7泳道為CT基因型，6泳道為T(mén)T基因型；B：rs4705343位點(diǎn)：2和7泳道為T(mén)T基因型，1、3、4、5和6泳道為CT基因型，8泳道為CC基因型

M： DNA marker；A： rs353292 site： lanes 1，2，3，4，5 and 8 are CC genotype，lane 7 is CT genotype，and lane 6 is TT genotype；B： rs4705343 site： lanes 2 and 7 are TT genotype，lanes 1，3，4，5 and 6 are CT genotype，and lane 8 is CC genotype

圖1含miR- 143/145 rs353292(A)和rs4705343(B)位點(diǎn)的DNA限制性?xún)?nèi)切酶譜

Fig1Gel electrophoresis map of the PCR products containing the rs353292(A) and rs4705343(B) polymorphisms of miR- 143/145 after digested by restriction endonucleases

表 2 對(duì)照組及CHD組中rs353292和rs4705343位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率Table 2 The genotype and allele frequencies of the rs353292 and rs4705343 polymorphisms in the control group or CHD group

miR-143/145基因rs353292位點(diǎn)不同基因型之間臨床資料比較在對(duì)照組中，TT基因型者TG(F=3.00，P=0.05)和血糖水平(F=9.91，P<0.001)高于C等位基因攜帶者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在CHD組中，TT基因型者h(yuǎn)s-CRP(F=8.43，P<0.001)水平高于C等位基因攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。其他指標(biāo)在rs353292位點(diǎn)不同基因型者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

miR-143/145基因rs4705343位點(diǎn)不同基因型者之間臨床資料比較在對(duì)照組中，TT基因型者患高血壓的比例高于C等位基因攜帶者(χ2=6.35，P=0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他指標(biāo)在rs4705343位點(diǎn)不同基因型者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表4)。

miR-143/145基因rs353292位點(diǎn)與CHD患者嚴(yán)重程度的相關(guān)性根據(jù)嚴(yán)重程度將CHD患者分為心絞痛組和心肌梗死組。TT基因型者中的心肌梗死發(fā)生率顯著高于C等位基因攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.29，P=0.02)(圖2)。

討 論

miR- 143和miR- 145兩個(gè)微小RNA基因位于人類(lèi)第5號(hào)染色體上，miR- 145基因在miR- 143基因的下游，二者彼此靠近，僅相隔1.6 kb，因此認(rèn)為它們是在同一啟動(dòng)子的調(diào)控下發(fā)生轉(zhuǎn)錄的，表示為miR- 143/145。rs353292和rs4705343是存在于miR- 143/145基因啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)單核苷酸變異位點(diǎn)，rs353292位點(diǎn)由轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的第673位C變異成T生成，次要等位基因T在亞洲人中的變異率為0.16～0.34，高加索人中為0.44～0.50，非洲人中為0.09。rs4705343位點(diǎn)由轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第400位T變異成C生成，次要等位基因C在亞洲人中的變異率為0.10～0.32，高加索人中為0.11～0.17，非洲人中為0.07(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)。

幾項(xiàng)病例-對(duì)照研究結(jié)果顯示這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與結(jié)腸癌、宮頸癌和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病相關(guān)[5- 6，11]，但這兩個(gè)位點(diǎn)是否也與CHD的發(fā)病及其嚴(yán)重程度相關(guān)報(bào)道較少。本研究在CHD患者中發(fā)現(xiàn)rs353292多態(tài)性TT基因型者血清hs-CRP水平顯著高于C等位基因攜帶者，同時(shí)在TT基因型患者中心肌梗死的發(fā)生率顯著高于C等位基因攜帶者(53.3%比32.6%)，推測(cè)rs353292多態(tài)性可能是通過(guò)影響miR- 143/145的基因表達(dá)，進(jìn)而影響hs-CRP的基因表達(dá)，促進(jìn)心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)在線(xiàn)預(yù)測(cè)(http：//www.targetscan. org)，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)CRP基因的3’UTR區(qū)含有miR- 145的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，其中has-miR- 145- 3p可識(shí)別CRP基因下游第1773～1779 bp的核苷酸序列，has-miR- 145- 5p可識(shí)別CRP基因下游第603～609 bp、1098～1105 bp和1541～1547 bp的核苷酸序列。Yuan等[5]

表 3 miR- 143/145基因rs353292位點(diǎn)不同基因型者之間生理生化指標(biāo)的比較Table 3 Physiological and biochemical parameters of the subjects according to the rs353292 genotypes

與CC基因型者比較，aP<0.05；與CT基因型者比較，bP<0.05

aP<0.05 compared with the subjects with the CC genotype；bP<0.05 compared with the subjects with the CT genotype

表 4 miR- 143/145基因rs4705343位點(diǎn)不同基因型者之間生理生化指標(biāo)的比較Table 4 Physiological and biochemical parameters of the subjects according to the rs4705343 genotypes

與TT基因型者比較，aP=0.01

aP=0.01 compared with the subjects with the TT genotype

與C等位基因攜帶者比較，aχ2=5.29，aP=0.02

aχ2=5.29，aP=0.02 compared with C allele carriers

圖2miR- 143/145基因rs353292位點(diǎn)不同基因型者中心絞痛及心肌梗死的發(fā)生率

Fig2Frequencies of angina pectoris or myocardial infarction in the genotype groups of the rs353292 polymorphism of the miR- 143/145 gene

采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析法發(fā)現(xiàn)rs353292多態(tài)性T等位基因?qū)iR- 143/145基因的表達(dá)具有抑制作用。結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，rs353292多態(tài)性T等位基因可能通過(guò)抑制miR- 145基因的表達(dá)，從而削弱miR- 145對(duì)CRP基因的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致CRP基因表達(dá)增強(qiáng)，血清hs-CRP水平升高，進(jìn)而影響心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展。然而，本研究在對(duì)照組中未觀察到TT基因型者血清hs-CRP水平顯著高于C等位基因攜帶者，可能原因之一是miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控存在共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即一個(gè)miRNA 分子可能對(duì)上百個(gè)靶基因進(jìn)行調(diào)控，而一個(gè)靶基因也可能被眾多的miRNA同時(shí)調(diào)控[12]。在CHD患者中，miR- 145與其他miRNA共同作用于CRP基因，使其表達(dá)增強(qiáng)；而在對(duì)照組中，雖然miR- 145表達(dá)也增強(qiáng)，但其他miRNA的種類(lèi)和數(shù)量的構(gòu)成不同于CHD患者，因此對(duì)CRP基因的調(diào)控模式也不相同。

大量研究資料表明，AS并不是簡(jiǎn)單的脂質(zhì)沉積過(guò)程，炎癥反應(yīng)和抗氧化失衡在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CRP是由肝細(xì)胞合成的一種相對(duì)分子質(zhì)量約為115 000的血清β球蛋白。臨床上通過(guò)高靈敏度方法檢測(cè)出來(lái)的血液微量CRP，稱(chēng)為hs-CRP。hs-CRP是CHD的危險(xiǎn)因素[13- 14]，其主要通過(guò)以下幾種機(jī)制在AS的形成、發(fā)展中發(fā)揮作用：(1)抑制主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的活性，減少一氧化氮的釋放[15]。一氧化氮可擴(kuò)張血管，并有抗氧化作用，減緩動(dòng)脈硬化進(jìn)程；(2)促進(jìn)單核細(xì)胞趨化因子- 1、血管細(xì)胞黏附分子- 1和細(xì)胞間黏附分子- 1的分泌[16- 17]。單核細(xì)胞趨化蛋白- 1、血管細(xì)胞黏附分子- 1和細(xì)胞間黏附分子- 1可募集循環(huán)血單核細(xì)胞并發(fā)生黏附，加速AS進(jìn)程；(3)促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞[18]。

本研究雖然在對(duì)照組中rs353292多態(tài)性與TG和血糖水平顯著相關(guān)，但其基因型及等位基因頻率在對(duì)照組與CHD組之間無(wú)差異。2013美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)治療血膽固醇降低成人動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)指南[19]和美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃成人治療組第3次指南[20]均將LDL-C作為心血管病第一干預(yù)和治療目標(biāo)，其他指標(biāo)作為補(bǔ)充指標(biāo)。TG和血糖水平與心血管病有一定的關(guān)聯(lián)性，但直接沉積于血管壁，形成粥樣斑塊的脂質(zhì)成分主要是膽固醇。盡管有報(bào)道rs4705343位點(diǎn)與宮頸癌[6]和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤[11]顯著相關(guān)，但本研究未觀察到該位點(diǎn)與心血管病危險(xiǎn)因素、CHD發(fā)病以及嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)，rs4705343位點(diǎn)與CHD的關(guān)系有待進(jìn)一步探討。

在對(duì)研究群體的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)中，rs353292和rs4705343位點(diǎn)基因型頻率在對(duì)照組和CHD組中的分布均不符合Hardy-Weinberg平衡，可能是因?yàn)楸狙芯康膶?duì)照組和CHD組均不是來(lái)源于隨機(jī)抽樣群體。對(duì)照組成員實(shí)際上是前往就診的疑似冠心病患者，然后行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)，但其冠脈狹窄程度沒(méi)有達(dá)到冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即至少1支冠狀動(dòng)脈或主要分支的管腔狹窄程度在50%以上。在對(duì)照組中，55%的參試者冠脈正常，34%的參試者有AS，11%的參試者有輕微的冠脈狹窄(<50%)。

綜上，在我國(guó)漢族人群中，miR- 143/145基因rs353292多態(tài)性在非CHD對(duì)照者中與血漿TG和血糖水平升高相關(guān)聯(lián)，在CHD患者中與血清hs-CRP水平升高和心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)聯(lián)。miR- 143/145基因rs4705343位點(diǎn)在非CHD對(duì)照者中可能與高血壓發(fā)病相關(guān)聯(lián)，但與CHD的發(fā)生和發(fā)展無(wú)相關(guān)性。