宋家樂，陳聰，黃柳燕，曾榛,3，高揚，吳華

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541100）（2.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009）（3.廣西高校預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣西桂林 541100）（4.揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇揚州 225001）

腸黏膜屏障是由腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的機械屏障，腸黏膜組織分泌的黏液和消化液所構(gòu)成的化學(xué)屏障，由腸道固有微生物菌落所構(gòu)成的生物屏障及主要腸道組織中免疫系統(tǒng)與其所分泌的免疫物質(zhì)構(gòu)成的免疫屏障等所構(gòu)成的具有維持腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能，阻隔外源性有害物質(zhì)進入血液循環(huán)系統(tǒng)的生物結(jié)構(gòu)[1]。腸黏膜屏障功能的異常是導(dǎo)致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，腸應(yīng)激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)及腸道腫瘤發(fā)生的重要原因[2]。腸上皮細胞和細胞間緊密連接所構(gòu)成腸上皮結(jié)構(gòu)在防止病原微生物入侵，細菌移位等方面具有重大意義[3]。臨床IBD患者腸上皮組織中的細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)遭受破壞，上皮細胞通透性增大，腸黏膜屏障損毀嚴重[4]。因此，改善腸上皮功能，維持細胞間緊密結(jié)構(gòu)完整則有助于改善IBD的臨床癥狀[5]。

柚子(Citrus maximaMerr.)是我國廣大南方地區(qū)栽培面積和產(chǎn)量較高的經(jīng)濟水果之一，屬蕓香科柑橘屬作物。研究發(fā)現(xiàn)，作為加工副產(chǎn)物的柚葉中含有豐富的多酚與黃酮類物質(zhì)[6,7]，是一種具有較好開發(fā)利用度的農(nóng)業(yè)資源廢棄物。近年來，多酚和黃酮類植物活性成分因其具抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能而越來越成為可持續(xù)性農(nóng)業(yè)和生物綜合利用研究和開發(fā)利用的重點[8]。

目前，柚葉總多酚提取物對于腸道上皮細胞高通透性保護作用的研究鮮見報道。人結(jié)腸癌Caco-2細胞是一株具有與正常小腸上皮細胞類似的緊密連接、微絨毛等結(jié)構(gòu)而被公認用于腸道屏障損傷與修復(fù)機制研究的經(jīng)典細胞系[9]。因此，本實驗通過利用LPS處理Caco-2腸上皮細胞制備細胞高通透性模型，研究柚葉總多酚對細胞高通透性的保護效果并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA 消化液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，美國 Thermo Scientific公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，日本 TAKARA 公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40，分子量 40000 u)、大腸桿菌脂多糖(LPS)，美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-8、TNF-α試劑盒，美國Cloud colon公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。新鮮柚葉采自廣西壯族自治區(qū)平樂縣龍窩果園，并經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA N-1001S真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；GR300型超聲波清洗機，山東國銳超聲機械有限公司；Biotek Elx808酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；ND2000超微量核酸蛋白測定儀、3110型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，美國 Thermo Scientific公司；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多公司上海有限公司；電熱恒溫水浴鍋 HWS-28，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀，德國BMG公司；MERS00002 Millicell-ERS上皮跨膜細胞電阻儀，美國Millipore公司。

1.3 柚葉總多酚提取物的制備

新鮮柚葉雙蒸水沖洗除雜后，真空冷凍干燥。凍干柚葉經(jīng)粉碎后過60目篩備用。取柚葉粉(10 g)加入250 mL乙醇(60%，V/V)后在63 ℃條件下超聲提取28 min(超聲功率245 W)[6]。濾液經(jīng)3000 r/min離心15 min后棄渣收集上清，50 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制成柚葉總多酚提取物(收率為30.54%)，-80 ℃儲存待用。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組

Caco-2人結(jié)腸腺癌細胞系(源自中國科學(xué)院上海細胞資源中心)由桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院鄒先瓊教授饋贈。細胞用DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。細胞貼壁長至80%時，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代，取指數(shù)期細胞用于實驗。

以DMEM 培養(yǎng)液(含LPS：2 μg/mL)處理細胞24 h制備細胞模型。模型細胞以柚葉總多酚提取物(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進行后續(xù)實驗。正常組為未經(jīng)過任何處理的正常Caco-2細胞。

1.5 MTT法測定細胞存活率及LDH脫氫酶水平

細胞按前述分組處理后，移除內(nèi)培養(yǎng)基(用于后續(xù)LDH酶活性測定)并加入100 μL的MTT試劑(終質(zhì)量濃度：0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入 DMSO (100 μL)避光振蕩 30 min，測定OD490 nm后按公式：細胞生存率(%)＝OD樣品組/OD正常組×100來計算細胞生存率。LDH脫氫酶水平采用比色試劑盒按照說明書操作要求進行測定。

1.6 模型細胞中細胞因子 IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的測定

細胞接種到培養(yǎng)板并依前述方法處理后，4 ℃下收集細胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照IL-1β、IL-8、TNF-α測定試劑盒說明書步驟操作(單位以pg/mL表示)。

1.7 模型細胞的膜通透性水平測定

依前述處理后的細胞接種至Transwell小室中，實驗前測定跨上皮細胞電阻(trans epithelial electrical resistance，TEER)檢查細胞融合狀態(tài)和腸上皮屏障的完整性，取細胞屏障完整的細胞(TEER≥100 Ω.cm2)用于實驗。移除Transwell小室內(nèi)外的培養(yǎng)液，HBSS液(pH 7.4)沖洗細胞 3 次，37 ℃孵育30 min 后測量TEER值，待TEER值穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。此外，在Transwell小室頂端腔內(nèi)加入100 μL的HBSS液(含有終濃度為1 mg/mL的FD-40)，37 ℃孵育2 h，收集側(cè)腔內(nèi)溶液，使用FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀測定熒光強度(激發(fā)波長 480 nm，發(fā)射波長 530 nm)。

1.8 qRT-PCR 法測定細胞中 IL-1β、IL-8、TNF-α、occludin、claudin-1、ZO-1 和 MLCK的mRNA表達

Trizol試劑盒法提取細胞內(nèi)總RNA，紫外分光檢測提純后的RNA濃度用于后續(xù)實驗。取總RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18引物(1 μL)、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(1 μL)、RNases抑制劑(1 μL)及5×Buffer (10 μL)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取適量cDNA (2 μL)用qRT-PCR法檢測occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的表達量。在總反應(yīng)體系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye (0.4 μL)和滅菌雙蒸水(5.6 μL)，充分混勻后置于 Quant Studio TM 6 Flex PCR 儀中進行反應(yīng)。擴增反應(yīng)條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，共 40 個循環(huán)，72 ℃延伸 5 min。每個基因cDNA樣本平行擴增3次，取Ct值均數(shù)，依公式計算目的基因表達量[F=2(檢測樣品中基因的Cr值-檢測樣品中持家基因的Cr值)/2(空白樣品中基因的Cr值-空白樣品中持家基因的Cr值)]。

各引物序列如下：IL-1β(上游：5’-GAATGACGCCCTCAATCAAAGT-3’， 下 游 ：5’-TCATCTTGGGCAGTCACATACA-3’)，IL-8 (上游：5’-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3’， 下 游 ：5’-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’)， TNF-α(上游 ： 5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’， 下 游 ：5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’)，Occludin(上游：5’-CTTCCAATGGCAAAGTGAATGAATGA-3’， 下游：5’-TACCACCGCTGCTGTAACGAG-3’)，claudin-1 (上游：5’-CCAGGTACGAATTTGGTCAGG-3’，下游：5’-TGGTGTTGGGTAAGAGGTTGT-3’)，ZO-1(上游：5’-GAGCCTAATCTGACCTATGAACC-3’， 下 游 ：5’-TGAGGACTCGTATCTGTATGTGG-3’)，MLCK(上游：5’-CAACAGGGTCACCAACCAGC-3’，下游：5’-GCCTTGCAGGTGTACTTGGC-3’)，GAPDH(上游：5’-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3’， 下 游 ：5’-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3’)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究中，所有實驗均重復(fù) 3次，結(jié)果以均值(means)±標(biāo)準偏差(SD)表示。所有實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 柚葉總多酚提取物對LPS所致Caco-2細胞生存率和細胞LDH釋放水平的影響

如表1示，Caco-2細胞在經(jīng)LPS(2 μg/mL)處理后細胞的生存率較正常組細胞相比下降至43.44%。給予不同濃度的柚葉總多酚提取物處理后，受損細胞的生存率顯著升高。

隨著柚葉總多酚提取物作用濃度的增加，受損細胞的生存率逐漸升高并呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。特別是在經(jīng)加高濃度(100 μg/mL 和 150 μg/mL)的柚葉總多酚提取物處理后，模式細胞的生存率分別升高至80.6%和86.1%，生存率分別較未經(jīng)處理的模型細胞生存率增高1.86倍和1.98倍。

LDH是一種在正常生理情況下穩(wěn)定存在于細胞內(nèi)部的功能酶。當(dāng)細胞遭受外界強烈的應(yīng)激刺激導(dǎo)致細胞膜損傷后，LDH能夠直接從細胞內(nèi)部溢出。因此，LDH被常用于作為一種有效的生物指標(biāo)來評估細胞損傷發(fā)生程度[10]。與正常組細胞相比，LPS模型組細胞中LDH的溢出量為正常組細胞的4.27倍。經(jīng)柚葉總多酚提取物處理模型細胞后，細胞 LDH的外溢水平顯著降低，且抑制效果存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。較高濃度的柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)處理后的細胞中LDH溢出水平分別較未經(jīng)處理的模型細胞 LDH溢出水平降低 39.2%和42.9%。

表1 柚葉總多酚提取物對LPS所致Caco-2細胞生存率和細胞LDH釋放水平的影響Table 1 Effects of PLTPE on cell viability and LDH levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.2 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的影響

LPS(2 μg/mL)刺激可顯著增加 Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌(圖1)。不同濃度的柚葉總多酚提取物干預(yù)模式細胞后，細胞內(nèi) IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌水平均得到顯著抑制。

圖1 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β(a)、IL-8(b)、TNF-α(c)分泌水平的影響Fig.1 Effects of PLTPE on IL-1β(a), IL-8(b) and TNF-α(c)levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

高濃度的柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和 150 μg/mL)能夠使細胞中的IL-1β水平分別較LPS模型細胞中IL-1β水平降低15.15%和19.3%，IL-8分泌水平降低23.0%和34.8%。而在TNF-α分泌水平方面，柚葉總多酚提取物(100 μg/mL 和 150 μg/mL)能夠使TNF-α水平分別較LPS模型細胞中TNF-α水平降低31.9%和 36.9%。臨床方面的研究提示，異常表達的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎細胞因子是導(dǎo)致腸組織細胞間緊密連接丟失以及細胞上皮屏障損傷的主要原因，同時也在潰瘍性結(jié)腸(ulcerative colitis)和克羅恩病(Crohn’s disease)的發(fā)病過程中起著重要的作用[11～15]。而本研究結(jié)果提示，柚葉總多酚對LPS所誘發(fā) 的Caco-2腸上皮細胞炎癥模型具有較好的抗炎效果。

2.3 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8與TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

如圖 2所示，LPS(2 μg/mL)處理能夠顯著刺激Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄。不同濃度的柚葉總多酚提取物處理細胞后，細胞內(nèi)IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均得到顯著抑制。較未經(jīng)過柚葉總多酚提取物處理的LPS模型組細胞而言，高濃度的柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)能夠分別有效降低LPS模型細胞中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平至16.8%和21.1%，IL-8轉(zhuǎn)錄水平至27.0%和35.6%。同時，柚葉總多酚提取物還能顯著抑制LPS模型細胞中TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平至26.5%和34.8%。抑制IL-1β、IL-8和TNF-α等炎癥細胞因子的過度表達，不僅能夠降低腸道組織的炎性水平，還能減緩高炎癥環(huán)境所導(dǎo)致腸上皮細胞間細胞緊密連接丟失的發(fā)生[1,12,13]。

2.4 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞的膜通透性影響

圖3 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞TEER(a)與FD-40(b)透過水平的影響Fig.3 Effects of PLTPE on TEER(a) and FD-40(b) flux levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

細胞膜通透性的改變程度能夠反映細胞間緊密連接和細胞單層屏障功能。如圖3a所示，LPS處理顯著造成Caco-2細胞中跨上皮細胞電阻(TEER)值的降低。而TEER值是用于檢測腸上皮細胞單層屏障功能變化的經(jīng)典生物指標(biāo)之一[16]，其主要反映腸上皮屏障模型的離子通透性改變情況[17]。給予不同濃度柚葉總多酚處理后，模型細胞的TEER值均顯著回升(p＜0.05)。其中，柚葉總多酚(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和150 μg/mL)處理組細胞分別較LPS組細胞的TEER值升高1.27倍、1.84倍、2.10倍和2.50倍。另一方面，異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40)透過度也屬于評估腸上皮細胞單層屏障功能變化的常用生物指標(biāo)[16]，其主要反映腸屏障細胞模型透過大分子物質(zhì)的能力，F(xiàn)D-40數(shù)值越高則意味著腸上皮屏障模型細胞通透性越高[18]。如圖3b所示，LPS處理顯著造成Caco-2細胞的通透性增高。經(jīng)柚葉總多酚處理后，模型細胞的 FD-40透過水平均呈顯著下降趨勢(p＜0.05)。柚葉總多酚(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 150 μg/mL)處理組細胞分別較LPS組細胞的FD-40透過水平降低8.06%、18.22%、24.86%和28.91%。以上結(jié)果提示，柚葉總多酚提取物可以顯著改善LPS所導(dǎo)致的Caco-2細胞高通透性情況的發(fā)生。

2.5 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞中 Occludin、claudin-1、ZO-1和 MLCK 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響

圖4 柚葉總多酚提取物對LPS處理Caco-2細胞中細胞間緊密連接相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effects of PLTPE on tight junction related factors mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

腸上皮屏障是由相鄰腸上皮細胞間緊密連接所形成的環(huán)帶狀蛋白復(fù)合體，其主要的生理功能在于調(diào)控物質(zhì)從細胞旁途徑跨上皮運輸，細胞間的構(gòu)造穩(wěn)定及細胞間的通訊等功能[19]。經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LPS處理造成Caco-2細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(圖4)。Occludin、claudin-1與ZO-1蛋白都是構(gòu)成緊密連接(tight junction，TJs)的重要結(jié)構(gòu)蛋白[20]。

與正常組相比，LPS組細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別下降62.56%，53.63%和58.62%。相反，給予柚葉總多酚處理后，模型細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著回升。高濃度柚葉總多酚提取物(100 μg/mL和150 μg/mL)能夠較LPS模型分別提升Occludin(1.57倍與1.78倍)、claudin-1(1.56倍與1.73倍)和ZO-1(1.73倍與2.02倍)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)屬一類鈣調(diào)素激酶，自身被激活后能夠通過促肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化使其參與肌動蛋白收縮，引發(fā)細胞骨架重排，破壞細胞TJ結(jié)構(gòu)，最終造成細胞間隙的開放，使得細胞間通透性增高[21]。如圖4示，LPS處理較正常組而言能顯著造成 Caco-2細胞中 MLCK的轉(zhuǎn)錄水平升高(p＜0.05)。柚葉總多酚處理后，模型細胞中MLCK的轉(zhuǎn)錄水平得到抑制。與 LPS組相比，最高濃度(150 μg/mL)的柚葉總多酚可顯著抑制MLCK的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(抑制率為31.30%)。抑制腸上皮細胞中MLCK的過度活化，對于維持腸上皮細胞屏障和細胞間緊密連接的重要作用[22]。

3 結(jié)論

本研究利用LPS構(gòu)建Caco-2腸上皮細胞高通透性細胞模型研究柚葉總多酚提取物對細胞高通透性的改善效果。結(jié)果提示，柚葉總多酚能夠有效抑制LPS造成的細胞損傷后 LDH外溢，提升細胞生存率。同時，柚葉總多酚可有效抑制 LPS誘發(fā)的 IL-1β、IL-8和TNF-α炎性細胞因子分泌并抑制其mRNA轉(zhuǎn)錄。此外，柚葉總多酚處理還能改善模型細胞的高通透性發(fā)生情況。在分子層面，柚葉總多酚能顯著上調(diào)受損細胞中 TJ相關(guān)因子(Occludin、claudin-1和 ZO-1)的mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制導(dǎo)致細胞 TJ丟失的 MLCK的mRNA高轉(zhuǎn)錄。綜上述，柚葉總多酚對 LPS所致Caco-2細胞發(fā)生高通透性的保護作用可能與其具有較強的抗炎作用以及對細胞TJ相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控能力有關(guān)。在后續(xù)研究中，課題組將重點針對柚葉總多酚是否具有MLCK活化過程中的上、下游信號通路的調(diào)控作用而展開深入研究。