焦迎春，曠慧，吳嘉南，何成日，陳啟和

（1.青海大學農牧學院，青海西寧 810016）（2.浙江大學食品科學與營養(yǎng)系，浙江杭州 310058）（3.韓德秀平壤輕工業(yè)大學食品科學研究所，朝鮮平壤）

柴 達 木 大 肥 菇 （Agaricus bitorquis(Quél.) Sacc.Chaidam）是青藏高原柴達木盆地特殊生態(tài)環(huán)境條件下的一種野生大型食用真菌，營腐生[1]。子實體肥大，子實體顏色從白色至暗黃色，平均重400 g～800 g，菌肉肥厚，味道細嫩鮮美[2]。菌肉結構緊密、含水量低、耐儲運，很受當地農牧民的喜愛，被廣泛采食和銷售。研究表明，柴達木大肥菇中必需氨基酸含量豐富，占氨基酸總量的35.84%，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維含量分別為24.0%，2.10%和17.32%，同時維生素B2和鉀、磷、鈣和鎂等礦質元素含量較高[3]。

運動性疲勞是一個極其復雜的身體變化綜合反應過程，研究證明在長時間高強度運動中，糖原耗盡、血糖濃度降低、乳酸堆積、尿素氮積累、運動過程中離子（如K+、Ca2+、Mg2+）等代謝紊亂、氧自由基的積累等因素都能誘發(fā)運動性疲勞的發(fā)生[4]。通過有針對性地補充外源性營養(yǎng)補劑或者藥物活性成分來延緩或者防止運動疲勞的發(fā)生，是解決運動性疲勞的有效途徑之一。目前相關研究表明，多糖不僅具有抗氧化、抗腫瘤、抗缺氧和預防心血管疾病等功能[5,6]，還具有抗疲勞作用[7]。Du等[8]研究發(fā)現，從粒毛盤菌中分離得到的多糖能延長小鼠力竭游泳時間，具有抗疲勞作用；Li等[9]研究發(fā)現從瑪卡中分離得到的多糖組分MPS-1和MPS-2均能延長小鼠的游泳時間，降低小鼠血清中LA、LDH和BUN水平，提高HG水平，表明該兩種多糖具有抗疲勞作用，且其抗疲勞活性呈現劑量效應。Ni等[10]研究表明，西藏地區(qū)生長的四種藥用植物多糖可以延長小鼠力竭游泳時間，降低血液中葡萄糖水平和超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，增加血液中尿素氮、甘油三酯、丙二醛水平和乳酸脫氫酶活性，從而表現出抗疲勞作用。

目前國內外關于柴達木大肥菇的研究較少，且主要集中于柴木大大肥菇子實體的營養(yǎng)成分分析、菌絲體生物學特性等相關的研究，而尚未見關于柴達木大肥菇多糖及其生物功能活性的研究。本研究通過采用熱水浸提法提取柴達木大肥菇子實體多糖、發(fā)酵液多糖和菌絲體多糖，并研究三種多糖對小鼠力竭游泳時間及力竭游泳結束后小鼠血液中Hb、血清中BUN、LDH和LA含量、肝臟中HG含量變化的差異性，研究柴達木大肥菇多糖的抗疲勞作用，為在青藏高原獨特生境下這一野生珍稀食用真菌的進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

SPF級昆明種小鼠（雌雄各半）購自甘肅中醫(yī)學院，體重 26～28 g。飼養(yǎng)環(huán)境適宜，通風，安靜，溫度為18～25 ℃，濕度為35%～50%。

1.1.2 試驗材料

野生型柴達木大肥菇子實體和斜面菌種均由青海省農林科學院野生所提供。挑選菇型整齊、發(fā)育成熟、無病蟲害的子實體進行凍干處理，得到的干粉冷藏（4 ℃）備用。

斜面菌種采用PDA斜面在23 ℃下活化15 d，得到的活化菌種4 ℃下保藏備用。

1.1.3 主要試劑

尿素氮（BUN）、氰化高鐵血紅蛋白（Hb）、乳酸（LA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肝糖原（HG）等試劑盒，南京建成生物工程研究所；紅景天苷（純度＞99%），國藥生物制品檢定所；DEAE-52纖維素，北京鼎國昌盛生物技術有限公司；葡聚糖系列標準品(3000、4320、12600、50000和110000 u)，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 infinity HPLC-GPC 系統(tǒng)，安捷倫科技有限公司；Agilent G1362A示差折光檢測器，安捷倫科技有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5417R小型臺式冷凍型離心機，德國 Eppendorf公司；Freezone 2.5冷凍干燥儀，美國Labconco公司；RV8旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA公司；電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；TU-181紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；SW-CJ-IQ單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖標準曲線制作

采用苯酚-硫酸法測定多糖濃度[11]。稱取干燥至恒重的標準無水葡萄糖20 mg，加入20 mL蒸餾水，配制成1 mg/mL的葡萄糖溶液。分別吸取0、0.1、0.2、0.3/、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 和 1 mL 葡萄糖溶液，用蒸餾水定容到1 mL，在1 mL多糖溶液中加入0.5 mL 6%苯酚溶液和 5 mL 濃硫酸，沸水浴中加熱15 min后冷卻，于490 nm下測定吸光值。以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制準曲線y=0.0121x+0.0564，R2=0.9988。

1.3.2 多糖提取

1.3.2.1 子實體多糖（PS）

參考文獻方法，采用熱水浸提法[12]。按料液比=1:20（g/mL）（柴達木大肥菇子實體干粉1 g:蒸餾水20 mL），于 80 ℃下水浴提取 3 h，離心、濃縮，得到子實體多糖提取物。

1.3.2.2 發(fā)酵液多糖（PFB）

取1 cm大小的斜面菌種2～3塊，接于液體種子培養(yǎng)基中（100 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)基組成為（g/L）：土豆提取物 200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g），于搖床避光震蕩培養(yǎng)（20±2 ℃，130±5 r/min）7～8 d。按照10%的接種量將種子液接種于新鮮液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（100 mL/250 mL三角瓶，培養(yǎng)基組成（g/L）：土豆 200 g，麥芽糖 35 g，CaCl20.1 g，復合維生素 B 1 g，蛋白胨5.5 g），放入搖床避光震蕩培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同上）[13]。將發(fā)酵液混合體系進行過濾，濾液即為發(fā)酵液。按料液比=1:5（mL/mL）（柴達木大肥菇發(fā)酵液 1 mL:蒸餾水 5 mL），于 80 ℃下水浴提取 3 h 后離心濃縮。

1.3.2.3 菌絲體多糖（PM）

將1.3.2.2中液體培養(yǎng)后的發(fā)酵液混合體系進行過濾，得到的固形菌絲體用蒸餾水沖洗3遍，放入干燥箱中進行烘干，用無菌處理后的研缽將菌絲體研碎，稱重。按料液比=1:10（g/mL）（柴達木大肥菇菌絲體干粉 1 g:蒸餾水 10 mL），于 80 ℃下水浴提取 3 h 后離心濃縮。

1.3.3 多糖處理

脫色：采用活性炭進行脫色[14]。在100 mL多糖液體中加入6 g活性炭水?。?0 ℃）脫色5 min，邊攪拌邊脫色。

脫蛋白：Sevage法脫蛋白[15]。V多糖溶液:VSevage試劑=1:2配置成混合溶液經過劇烈振搖 20～30 min脫蛋白，VSevage試劑=V正丁醇:V氯仿=1:5。蛋白質變性后形成凝膠沉淀，通過離心分離后分出水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。從得到的粗多糖經過脫蛋白后，計算柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液、菌絲體中多糖含量分別為：

15.25±0.13 g/100 g、11.98±0.09 g/100 mL、48.14±0.11 g/100 g。

純化：分別稱取脫蛋白后的子實體、發(fā)酵液、菌絲體粗多糖 100 mg溶解于 5 mL去離子水中，用DEAE-52纖維素層析柱層析。用去離子水洗脫，流速0.5 mL/min，分部收集，每管5 mL，苯酚-硫酸法檢測各管多糖含量（波長490 nm處吸光度），分別收集不同的組分，合并相同組分，50 ℃減壓蒸發(fā)濃縮，透析48 h后將透析液真空冷凍干燥，得純化后的柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液、菌絲體多糖凍干后冷藏，備用。

1.3.4 多糖分子量測定

1.3.4.1 色譜條件

色譜條件：Agilent PL aquagel-OH 40（8 μm，300 mm×7.5 mm）凝膠色譜柱；柱溫35 ℃；流動相為純水；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。檢測器為示差折光檢測器（RID）。

1.3.4.2 多糖標準品分子量大小測定

采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定多糖分子量大小。將一系列葡聚糖標準品用流動相溶解，配制質量濃度為1.0 mg/mL的系列標準溶液，搖勻，過0.45 μm水系納濾膜后按照1.3.4.1中的色譜條件測定系列葡聚糖標品的分子量，以標準品相對分子質量的對數值為縱坐標，以相應色譜峰的保留時間為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程y=-0.1732x+7.6534（R2=0.9951），根據回歸方程計算多糖相對分子質量。 1.3.4.3 樣品分子量測定

分別將柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液、菌絲體多糖用流動相配成質量濃度為2 mg/mL的樣液，經0.45 μm水系濾膜過濾后按照1.3.4.1中的色譜條件測定多糖的分子量。根據其保留時間和多糖分子量標準曲線，計算柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液、菌絲體多糖的分子量大小。

1.3.5 多糖對小鼠的抗疲勞活性

1.3.5.1 動物分組

將 100只小鼠隨機分為空白組（Control），紅景天苷組（Rhodiola），子實體組（PS），發(fā)酵液組（PFB）和菌絲體組（PM），每組20只，雌雄各半。分別將純化后的子實體多糖、發(fā)酵液多糖和菌絲體多糖中3個組分按照自然比例混合，得到純化后的子實體混合多糖、發(fā)酵液混合多糖和菌絲體混合多糖，喂養(yǎng)小鼠。每天在灌胃前兩個小時停止喂食，按照100 mg/kg的劑量對5組實驗小鼠分別進行灌胃35 d，空白組以同等體積的生理鹽水進行灌胃。 1.3.5.2 小鼠的力竭游泳實驗

參考West等[17]方法，略有改進。在第35 d灌胃結束后，60 min后稱量每只小鼠的體重，在水桶（高30 cm，直徑25 cm）內放入一定量的水，水的高度為20 cm，并保持水溫在25 ℃，一桶一鼠。當小鼠頭部露出水面超過10 s，同時漂浮不動時視為體力耗竭，立即記錄小鼠游泳時間。

1.3.5.3 生化指標測定

小鼠游泳實驗結束后，立即用乙醚麻醉，采樣，測定生化指標。

（1）全血的采集：采用摘眼球法收集全血，按照試劑盒說明書檢測Hb含量。

（2）血清的采集：將收集的全血進行低溫離心（4 ℃，8000 r/min，10 min），上清液（即為血清）放入-20 ℃冰箱中保存，按照試劑盒說明書檢測血清中LD、LDH、BUN含量。

（3）肝臟的收集：待全血取出后，立即將小鼠肝臟取出，用低溫生理鹽水漂洗3次，濾紙吸干后稱量每只小鼠肝臟重量，將小鼠肝臟組織放入-20 ℃冰箱中保存，按照試劑盒說明書檢測HG含量。

1.4 數據處理

數據以平均值（x）+標準差（SD）表示，并分別采用SPSS 19.0軟件和Origin 8.5軟件對數據進行處理分析和作圖。

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 PS、PFB、PM分子量的測定

由表1可知，從柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液和菌絲體中均分離得到3種多糖組分，但3種多糖的分子量大小存在差異。在3種多糖組分中，從子實體多糖分離出來的3個多糖組分分子量均較大，其次是菌絲體多糖，而發(fā)酵液多糖組分的分子量相對最小。其中 PS-Ⅰ、PFB-Ⅰ、PM-Ⅰ所占的比例較大，其次為PS-Ⅱ、PFB-Ⅱ、PM-Ⅱ，而 PS-Ⅲ、PFB-Ⅲ、PM-Ⅲ所占的比例最小。

圖1 PS（a）、PFB（b）、PM（c）的HPGPC 圖譜Fig.1 HPGPC chromatograms of PS (a), PFB (b) and PM (c)

表1 PS、PFB、PM分子量的測定Table 1 Determination of the molecular weights of PS, PFB and PM fractions

2.1.2 PS、PFB、PM 對小鼠力竭游泳時間的影響

運動耐力是抗疲勞活性的一個直接反映指標，小鼠力竭游泳試驗被廣泛用做檢測多糖的抗疲勞活性[18]。由圖2可知，與空白對照組和陽性對照組（紅景天苷組）相比，子實體多糖組、發(fā)酵液多糖組、菌絲體多糖組的小鼠力竭游泳時間均顯著延長（p＜0.05）；3種多糖組中小鼠力竭游泳時間從大到小的排列順序為：發(fā)酵液多糖＞菌絲體多糖＞菌絲體多糖，且三組之間具有顯著差異性（p＜0.05）。菌絲體多糖組的小鼠力竭游泳時間最長，為 89.97±4.38 min，分別是空白組和紅景天苷組小鼠力竭游泳時間的3.03倍和1.81倍。發(fā)酵液多糖組和子實體多糖組小鼠的力竭游泳時間分別是空白組的2.33倍和1.93倍。結果表明，柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液和菌絲體多糖可以延長小鼠力竭游泳時間，具有抗疲勞活性，且菌絲體的抗疲勞活性優(yōu)于發(fā)酵液多糖和子實體多糖。

圖2 PS、PFB、PM對小鼠游泳時間的影響Fig.2 Effect of PS、PFB、PM on the forced swimming time of mice

2.1.3 PS、PFB、PM對小鼠血液中Hb含量的影響

圖3 PS、PFB、PM對小鼠血液中Hb含量的影響Fig.3 Effect of PS, PFB, PM on Hb in blood serum of mice

劇烈運動導致機體對氧氣的需求量增加，在運動疲勞中，Hb水平可以作為在機體生理變化的一個重要反映指標[19]。由圖3可知，與空白對照組相比，3種多糖組的小鼠血清中Hb含量均有所提高，其中菌絲體多糖組的小鼠血液中Hb含量最高（517.48±101.69 mg/mL），顯著大于空白對照（236.72±15.20 mg/mL）和陽性對照組（345.12±15.28 mg/mL）。子實體和發(fā)酵液多糖組的小鼠血液中Hb含量無顯著差異，分別為（355.32±49.53 mg/mL）和（417.87±53.94 mg/mL）（p＞0.05）；子實體多糖組的小鼠血液中Hb含量顯著高于空白對照組（p＜0.05），但發(fā)酵液多糖組小鼠血液中Hb含量與空白對照組和陽性對照組均無顯著差異（p＞0.05）。

2.1.4 PS、PFB、PM對小鼠血清中BUN、LA和LDH含量的影響

2.1.4.1 PS、PFB、PM對小鼠血清中BUN含量的影響

圖4 PS、PFB、PM對小鼠血液中BUN含量的影響Fig.4 Effect of PS, PFB, PM on BUN in blood serum of mice

BUN、LA和LDH的變化可以直接反應機體疲勞情況的變化，也可用來評價抗疲勞活性的有效反應指標。在運動耐力過程中，BUN含量顯著下降表明機體能有效緩解運動疲勞[20]。由圖4可知，與空白對照組相比（16.28±0.04 mmol/L），子實體多糖組、發(fā)酵液多糖組、菌絲體多糖組和陽性對照組小鼠血清中 BUN含量均顯著下降（p＜0.05），且分別下降了 65.78%、69.14%、72.79%和 25.68%。3種多糖組小鼠血清中BUN 含量均無顯著差異（p＞0.05），但均顯著高于與陽性對照組（p＜0.05）。

2.1.4.2 PS、PFB、PM對小鼠血清中LA和LDH含量的影響

圖5 PS、PFB、PM對小鼠血液中LA和LDH含量的影響Fig.5 Effect of PS, PFB, PM on LA and LDH in blood serum of mice

在高強度的劇烈運動中，血清中LA含量通常會升高，同時乳酸與運動過程中肌肉力量的減弱和肌肉酸痛的產生密切相關[21]。LDH可以催化丙酮酸和乳酸的相互轉化，在運動過程中，LDH活性的增加和LA含量的下降有助于緩解運動疲勞，提高運動耐力[21]。由圖 5 可知，與空白對照組相比（24.32±2.65 mmol/L），3種多糖組和陽性對照組小鼠血清中LA含量均顯著下降（p＜0.05），且分別下降了25.21%、34.29%、37.34%和37.95%；雖然3組多糖組與陽性對照組之間均無顯著差異（p＞0.05），但多糖組小鼠血清中LA含量低于陽性對照組。同時與空白對照組相比，3種多糖組和陽性對照組小鼠血清中 LDH活性均顯著升高（p＜0.05），且分別升高了 34.47%、38.29%、43.72%和27.03%。雖然3組多糖組與陽性對照組之間均無顯著差異（p＞0.05），但陽性對照組小鼠血清中LDA含量低于3種多糖實驗組，且菌絲體多糖組小鼠血清中LDA 含量最高，為（14.30±0.69 KU/L）。

2.1.5 PS、PFB、PM 對小鼠肝臟中 HG 含量的影響

圖6 PS、PFB、PM對小鼠肝臟中HG含量的影響Fig.6 Effect of PS, PFB, PM on HG in mice liver

在劇烈運動過程中，除了葡萄糖，HG是主要的能源物質，增加肝糖原儲備有利于提高運動耐力和運動能力[22]。由圖6可知，與空白對照組相比（17.61±1.29 mg/g），子實體多糖組、發(fā)酵液多糖組和菌絲體多糖組的小鼠肝臟中肝糖原的含量顯著升高（p＜0.05），且菌絲體多糖組的小鼠肝臟中肝糖原含量最高（127.65±18.34 mg/g），顯著高于子實體多糖組和發(fā)酵液多糖組（分別為 47.14±7.87、53.72±0.18 mg/g）（p＜0.05）。子實體多糖組和發(fā)酵液多糖組小鼠肝臟中肝糖原含量大于陽性對照組，但無顯著差異（p＞0.05）。

2.2 討論

柴達木大肥菇子實體、發(fā)酵液和菌絲體多糖的分子量大小不同，它們的抗疲勞活性具有差異性，該差異性可能與多糖的結構、分子量大小相關。Li等[9]研究表明，從瑪卡中分離得到的兩種多糖（MPS-1和MPS-2）平均分子量分別為 7.6×103u 和 6.7×103u；MPS-1是由木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成，而MPS-2是由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖構成；在小鼠的被迫游泳實驗過程中，分子量較小的 MPS-2比MPS-1抗疲勞活性更強。

研究表明，多糖的抗疲勞作用機理可能與多糖能緩解生物體氧化應激損傷有關，相關研究表明，在抗疲勞實驗中，多糖會顯著影響 MDA、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽酶（GSH-Px）水平[23,24]。Wang等[24]研究表明，人參多糖具有抗疲勞作用，可以提高LDH、肌酸磷激酶（CK）、葡葡萄糖和MDA水平，降低血清中TG和GSH-Px水平，其抗疲勞作用機理可能是通過調節(jié)抗氧化酶的活性來減慢脂質氧化過程，從而減弱細胞膜的氧化損害。同時他們推測，血清中TG水平的降低和葡萄糖水平的持續(xù)升高可能表明運動過程中合成的 TG被機體不斷利用來提供能量，導致糖原和葡萄糖積累，從而可以緩解運動疲勞。在劇烈運動過程中，Hb含量的升高可以幫助提高小鼠細胞內氧氣運輸的能力增強，從而提高細胞的有氧呼吸作用[25]。隨著細胞的有氧呼吸作用增強，運動過程中積累的LA被消耗或LA的合成作用減弱，同時伴隨著 LDH的活性增強和葡萄糖的積累，該過程有利于緩解運動過程中肌肉疲勞和緊張，從而提高運動耐力[26]。目前對柴達木大肥菇的基礎研究比較少，而對柴達木大肥菇活性多糖的生物學功能研究地更少。本研究結果發(fā)現柴達木大肥菇多糖具有抗疲勞活性，但是其抗疲勞作用機理還有待深入研究。下一步研究可以從多糖分子結構與抗疲勞活性之間的構效關系、運動過程中脂類代謝、能量代謝、葡萄糖代謝和相關抗氧化酶活性的變化等方面來闡明柴達木大肥菇多糖的抗疲勞作用機理。

3 結論

通過比較柴達木大肥菇子實體多糖、發(fā)酵液多糖和菌絲體多糖對小鼠力竭游泳時間及力竭游泳結束后小鼠血液中Hb、血清中BUN、LDH和LA含量、肝臟中HG含量變化的差異性，結果表明柴達木大肥菇子實體多糖、發(fā)酵液多糖和菌絲體多糖通過延長小鼠力竭游泳時間、提高小鼠血液中 Hb、HG和血清中LDH含量、降低小鼠血清中BUN和LA含量，從而提高小鼠的運動耐力、緩解運動疲勞。說明該3種多糖具有抗疲勞作用，且菌絲體多糖的抗疲勞效果優(yōu)于子實體多糖和發(fā)酵液多糖，但是柴達木大肥菇多糖的抗疲勞作用機制還需進一步研究。