賀子倩，彭青，蔡道琳，王萍

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

狹葉蕁麻（Urtica Angustifolia）是一種藥食兩用的傳統(tǒng)山野菜，黑龍江省分布較廣。國外對蕁麻屬植物的研究相對較早，尤其是對狹葉蕁麻的同屬植物，如歐蕁麻、麻葉蕁麻、異株蕁麻的開發(fā)，并對異株蕁麻不同部位的化學成分進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)其活性成分主要有甾醇、黃酮類、有機酸類、酚類、苯丙素類、植物蛋白質(zhì)、多糖及其他類化合物[1～3]。國內(nèi)關(guān)于狹葉蕁麻的研究較少，據(jù)報道，狹葉蕁麻根中含有黃酮、甾醇、苷類、酚類化合物及糖類、蛋白質(zhì)等成分；莖中含有多糖類、甾體及萜類、有機酸等成分；葉中含有色素、黃酮、甾醇、苷類、糖類、蛋白質(zhì)和油脂等成分[4]。

王靜等采用了亞臨界萃取技術(shù)對新疆野生狹葉蕁麻中的黃酮類化合物進行提取[5]。杜宏濤等通過響應面法優(yōu)化了超聲波提取狹葉蕁麻中黃酮和木脂素的工藝[6]。張海悅、李茜采用了超聲波輔助提取狹葉蕁麻生物堿[7]。張海悅和郭新力以狹葉蕁麻葉為原料，采用乙醇提取得到了一種甾體皂苷[8]。國內(nèi)外對狹葉蕁麻的作用研究較少，多利用小鼠建立模型、采用體內(nèi)試驗研究其提取物的活性。崔殿波和李薇等研究發(fā)現(xiàn)了狹葉蕁麻乙酸乙酯提取物能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹、蛋清所致大鼠足腫脹，并對醋酸所致小鼠扭體反應以及對熱板小鼠表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛作用[9]。秦元滿和魏恩科研究發(fā)現(xiàn)了狹葉蕁麻甲醇提取液能明顯延長小鼠的凝血時間和出血時間[10]。

本研究利用乙醇溶液提取狹葉蕁麻中活性物質(zhì)，在單因素試驗的基礎上利用響應面法得到最佳提取條件，對其提取物進行活性物質(zhì)含量的測定，同時進行體外抗氧化及抗炎活性評價，為推動國內(nèi)狹葉蕁麻的資源利用，為開發(fā)新型功能食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹葉蕁麻采自小興安嶺地區(qū)，經(jīng)曬干粉碎，過40目篩后于室溫下密封保藏。

藥品試劑：沒食子酸標準品、蘆丁標準品、兒茶素標準品、薯蕷皂苷元標準品、澳洲茄胺標準品，均購自上海源葉生物科技有限公司；其他藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型精密pH計，上海精密儀器有限公司；TU-1810型PC722s分光光度計，上海精密儀器有限公司；DK-S12電熱恒溫水浴鍋，上海森信試驗儀器有限公司。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗設計

取狹葉蕁麻粉末5.00 g，使用不同濃度的乙醇溶液浸提，旋蒸、定容至相同體積。考察的單因素及水平設計為提取時間：60、90、120、150、180 min；提取溫度：室溫、35、45、55、65 ℃；提取料液比：1:10、1:15、1:20、1:25、1:30；乙醇濃度：40%、60%、70%、80%、100%。

1.3.2 響應面法優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，選取料液比、乙醇濃度、浸提時間作為3因素，并以總還原能力和透明質(zhì)酸酶抑制率作為響應值，采用Box-Behnken中心組合試驗來確定最優(yōu)提取條件。

1.4 活性物質(zhì)含量測定方法

總酚含量的測定：福林酚-肖卡法[11]，以沒食子酸為標品；總黃酮含量的測定：亞硝酸鈉-亞硝酸鋁法[12]，以蘆丁為標品；原花青素含量的測定：香草醛-濃硫酸法[13]，以兒茶素為標品；皂苷含量的測定：香草醛-冰醋酸法[14]，以薯蕷皂苷元為標品；生物堿含量的測定：酸性染料法[15]，以澳洲茄胺為標品。

計算公式為X=(C×N×V)/M

注：C為活性物質(zhì)濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為狹葉蕁麻提取樣液體積，mL；M為狹葉蕁麻醇提物質(zhì)量，g。

1.5 狹葉蕁麻醇提物抗氧化及抗炎活性評價方法

1.5.1 體外抗氧化活性評價方法

清除DPPH·能力：參考文獻[16]的方法，略有改動；清除·OH 能力：硫代巴比妥酸法[17]，用 2-脫氧-D-核糖作底物；總還原能力：FRAP法[18]。

1.5.2 體外抗炎活性評價方法

抑制透明質(zhì)酸酶能力：參考文獻[19]方法，略改動；抑制白蛋白變性能力：參考文獻[20,21]方法，略改動。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)±sd表示，采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理，Design-Expert 8.0.6進行試驗設計及分析，Origin 85進行作圖，以p<0.05為統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間的影響

其他因素不變情況下，提取時間對狹葉蕁麻醇提物抗氧化以及抗炎活性影響如圖1所示，從圖1可以看出，狹葉蕁麻醇提物總還原能力在120 min出現(xiàn)最大值，透明質(zhì)酸酶抑制率在120 min出現(xiàn)最大值。隨著時間的延長，活性物質(zhì)的溶出量增多。因此提取時間120 min為較優(yōu)水平。

2.1.2 提取溫度的影響

圖2 提取溫度對抗氧化及抗炎活性的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on antioxidation and anti-inflammatory

其他因素不變情況下，提取溫度對狹葉蕁麻醇提物抗氧化以及抗炎活性影響如圖2所示。從圖2可以看出，狹葉蕁麻醇提物總還原能力在室溫出現(xiàn)最大值，透明質(zhì)酸酶抑制率在室溫出現(xiàn)最大值。

隨著溫度的緩慢上升，狹葉蕁麻醇提物抗氧化能力及抗炎活性逐漸增強，說明溫度對狹葉蕁麻活性物質(zhì)的提取有一定促進作用，而溫度過高則影響提取物活性，抗氧化及抗炎活性會減弱。綜合考慮能源的消耗，因此提取溫度選為室溫進行下一步 Box-Behnken中心組合試驗。

2.1.3 提取料液比的影響

圖3 提取液料比對抗氧化及抗炎活性的影響Fig.3 The effect of extraction solid-liquid on antioxidation and anti-inflammatory

其他因素不變情況下，提取料液比對狹葉蕁麻醇提物抗氧化以及抗炎活性影響如圖3所示。從圖3可以看出，狹葉蕁麻醇提物總還原能力在料液比為1:20出現(xiàn)最大值，透明質(zhì)酸酶抑制率在料液比為1:20出現(xiàn)最大值。狹葉蕁麻醇提物抗氧化及抗炎活性在料液比為1:20左右達到較高值。說明了料液比過小導致活性物質(zhì)得不到充分提取，而料液比過大也影響提取率。因此料液比1:20為較優(yōu)水平。

2.1.4 乙醇濃度的影響

圖4 乙醇濃度對抗氧化及抗炎活性的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on antioxidation and anti-inflammatory

其他因素不變情況下，乙醇濃度對狹葉蕁麻醇提物抗氧化以及抗炎活性影響如圖4所示。從圖4可以看出，狹葉蕁麻醇提物總還原能力在乙醇濃度為60%出現(xiàn)最大值，透明質(zhì)酸酶抑制率在乙醇濃度為60%出現(xiàn)最大值，同時綜合在單因素試驗時的其他指標（另文），選取乙醇濃度70%為較優(yōu)水平。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，Box-Behnken中心組合試驗水平設置及編碼見表1。

表1 Box-Behnken中心組合試驗設計因素水平Table 1 Factors and Levels in the Box-Benhnken Design

2.2 Box-Behnken中心組合試驗結(jié)果

圖5 提取時間與液料比的交互作用響應面Fig.5 The response surface methodology of extraction time and solid-liquid interactions

圖6 提取時間與乙醇濃度的交互作用響應面Fig.6 The response surface methodology of extraction time and ethanol concentration interactions

在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken中心組合試驗進一步優(yōu)化提取條件。Box-Behnken中心組合試驗設計結(jié)果見表2，試驗方差分析見表3。

將表3的試驗數(shù)據(jù)進行擬合，分別得到總還原能力（mmol/L FeSO4）和透明質(zhì)酸酶抑制率（%）的模擬方程：

Y1=1.16+0.033A-0.033B-0.31C+0.086AB+7.399E-003AC-0.022BC-0.18A2-0.070B2-0.33C2

Y2=73.92+2.64A-3.22B-13.46C+4.54AB+10.31AC+3.08BC-10.34A2+1.03B2-23.45C2

表2 Box-Behnken中心組合試驗設計結(jié)果Table 2 Results of the Box-Benhnken Design

由表3的方差分析結(jié)果可知，將總還原能力作為響應值，該模型p<0.0001，說明該模型極顯著；失擬誤差p>0.05，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.9890，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。方程一次項系數(shù)C、二次項系數(shù)A2、C2和AB交互作用具有極顯著性，方程二次項系數(shù)B2具有顯著性。各因素對總還原能力的影響的順序為：乙醇濃度>提取時間>提取液料比。

提取時間與液料比交互作用對總還原能力具有極顯著的影響。圖5為提取時間與液料比的交互作用對總還原能力的影響。

將透明質(zhì)酸酶抑制率作為響應值，該模型p為0.0004，說明該模型極顯著；失擬誤差p>0.05，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.9613，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。方程一次項系數(shù)C、二次項系數(shù)A2、C2和AC交互作用具有極顯著性。各因素對透明質(zhì)酸酶抑制率的影響的順序為：乙醇濃度>提取液料比>提取時間。提取時間與乙醇濃度交互作用對透明質(zhì)酸酶抑制率具有極顯著的影響。圖6為提取時間與乙醇濃度的交互作用對透明質(zhì)酸酶抑制率的影響。

表3 Box-Behnken中心組合試驗方差分析Table 3 Box-Behnken and analysis of variance

通過Box-Behnken中心組合試驗得到的最佳提取工藝條件為：提取時間為114 min、提取料液比為1:15、乙醇濃度為64%。在此條件下對狹葉蕁麻進行提取得到的醇提物，得率為（10.00±0.26）%，總還原能力為（1.20±0.007）mmol/L FeSO4，透明質(zhì)酸酶抑制率為（81.42±0.62）%，與模型預測誤差值分別為0.84%和0.30%，說明預測較可靠。因此，BoX-Behnken中心組合試驗對狹葉蕁麻提取條件的參數(shù)優(yōu)化是可行的，得到的工藝條件具有實際應用價值。

2.3 狹葉蕁麻醇提物中活性物質(zhì)的含量

在響應面優(yōu)化后的提取條件下提取，測定其醇提物中的活性物質(zhì)含量?？偡樱?60.77±0.01）mg/g、總黃酮（366.85±0.05）mg/g、原花青素（7.81±0.01）mg/g、皂苷（516.76±0.04）mg/g、生物堿（2.01±0.02）mg/g。

2.4 狹葉蕁麻醇提物的體外抗氧化活性評價結(jié)果

在響應面優(yōu)化后的提取條件下提取，采用抗壞血酸（Vc）作抗氧化陽性對照，對所得狹葉蕁麻醇提物進行清除DPPH·、清除·OH、總還原力活性評價。

2.4.1 清除DPPH·能力

狹葉蕁麻醇提物對 DPPH·的清除作用如圖 7所示。從圖7可以看出，狹葉蕁麻醇提物對DPPH·具有顯著的清除作用（p<0.001），量效關(guān)系明顯（y=-33265x2+3226.9x+3.0615，R2=0.9936），在 0.05 mg/mL時達到（81.02±0.03）%。以Vc做陽性對照，在0.05 mg/mL時達到（71.63±0.33）%。狹葉蕁麻醇提物和Vc的IC50分別為0.02 mg/mL和0.03 mg/mL。Vc具有遞電子和遞質(zhì)子能力，對 DPPH·的清除作用是通過抗氧化劑把電子和質(zhì)子傳遞給DPPH·，從而生成穩(wěn)定的分子態(tài)的DPPH2[22]。抗氧化劑對DPPH·的清除是通過抗氧化劑遞氫及遞電子進行的，由于狹葉蕁麻醇提物中酚酸、黃酮、原花青素[23]等抗氧化劑的協(xié)同作用，使得對 DPPH·的清除能力超過了陽性對照Vc（p<0.001）。

圖7 狹葉蕁麻醇提物對DPPH·清除作用Fig.7 The ethanol extractions of Urtic Angustifolia on DPPH· scavenging capacities

2.4.2 清除·OH能力

圖8 狹葉蕁麻醇提物對·OH清除作用Fig.8 The ethanol extractions of Urtic Angustifolia on ·OH scavenging capacities

狹葉蕁麻醇提物對·OH的清除作用如圖8所示。從圖8可以看出，狹葉蕁麻醇提物對·OH具有顯著的清除作用（p<0.001），·OH清除與狹葉蕁麻醇提物質(zhì)量濃度之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性，量效關(guān)系呈良好的線性關(guān)系（y=9.9858x+31.764，R2=0.9979）。以Vc做陽性對照，在6.0 mg/mL時分別達到（91.27±0.43）%和（54.69±0.34）%。狹葉蕁麻醇提物和Vc的IC50分別為1.87 mg/mL和4.98 mg/mL。雖然Vc的還原性很強，還能阻斷Fenton反應，但是狹葉蕁麻中總黃酮、總酚、原花青素類的物質(zhì)含量高，對·OH的敏感程度高出Vc，清除·OH能力遠高于Vc（p<0.001）。

2.4.3 總還原能力

圖9 狹葉蕁麻醇提物的總還原能力Fig.9 The reducing power of ethanol extractions from Urtica Angustifolia

經(jīng)測定，回歸方程為 y=0.5765x+0.2207，R2為0.9992，在0.0～1.5 mmol/mL線性關(guān)系良好。狹葉蕁麻醇提物的總還原能力如圖 9所示。從圖 9中可以看出，狹葉蕁麻醇提物的總還原能力較強，且隨著濃度的不斷提高影響也越顯著（p<0.001），在0.1 mg/mL時達到（1.20±0.01）mmol/L FeSO4。醇提物和Vc的EC50分別是0.04 mg/mL、0.10 mg/mL（以吸光值A=0.5，即0.48 mmol/L FeSO4計算EC50）。狹葉蕁麻醇提物中除多酚類外，尚有皂苷、生物堿等抗氧化活性物質(zhì)，使得總還原力強于 Vc。因此，狹葉蕁麻醇提物的總還原能力高于陽性對照Vc。

2.5 狹葉蕁麻醇提物的體外抗炎活性評價

在響應面優(yōu)化后的提取條件下提取，采用雙氯芬酸鈉作為抗炎陽性對照，對所得狹葉蕁麻醇提物進行抑制透明質(zhì)酸酶、抑制白蛋白變性活性評價。

2.5.1 透明質(zhì)酸酶活性的抑制

圖10 狹葉蕁麻醇提物對透明質(zhì)酸酶的抑制作用Fig.10 The ethanol extractions of Urtica Angustifolia on inhibiting hyaluronidase activities

狹葉蕁麻醇提物對透明質(zhì)酸酶的抑制作用如圖10所示。從圖10可以看出，狹葉蕁麻醇提物在高濃度 6.5 mg/mL時對透明質(zhì)酸酶有較高的抑制率，為（93.14±0.08）%，與陽性對照雙氯芬酸鈉（98.44±0.23）%相近。狹葉蕁麻醇提物的IC50為2.44 mg/mL。狹葉蕁麻醇提物中的皂苷、生物堿均具有抗炎活性[24]，在一定濃度時能對透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生抑制作用。黃酮類被證實能夠抑制透明質(zhì)酸酶活性，但作用機制尚不明確[25]，這說明其是有效的透明質(zhì)酸酶抑制劑。雙氯芬酸鈉在較低濃度時也對透明質(zhì)酸酶有較高的抑制率且高于狹葉蕁麻醇提物。

2.5.2 白蛋白變性的抑制

圖11 狹葉蕁麻醇提物對白蛋白變性的抑制作用Fig.11 The ethanol extractions of Urtica Angustifolia on inhibiting albumin denaturation activities

狹葉蕁麻醇提物對白蛋白變性的抑制作用如圖11所示。從圖 11可以看出，狹葉蕁麻醇提物在 0.5 mg/mL時對白蛋白變性的抑制率為（84.14±0.57）%，與陽性對照雙氯芬酸鈉（97.58±0.34）%相近。狹葉蕁麻醇提物與陽性對照雙氯芬酸鈉的IC50值分別為0.31 mg/mL和0.19 mg/mL。內(nèi)源性蛋白的變化是一種誘發(fā)慢性炎癥疾病的病因[26]，狹葉蕁麻醇提物中皂苷、生物堿通過抑制炎癥因子[24]，起到抗炎作用。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken組合試驗，選取提取時間、提取料液比、乙醇濃度為因素確定三水平，以總還原能力和抑制透明質(zhì)酸酶能力為響應值來確定最優(yōu)提取條件。進行試驗后，得到優(yōu)化后的提取條件：提取時間 114 min，料液比1:15，提取溶劑乙醇濃度為64%。在此條件下得到的狹葉蕁麻醇提物具有良好的抗氧化活性和抗炎活性。狹葉蕁麻醇提物對DPPH·、·OH清除效果顯著，IC50分別是0.02 mg/mL、1.87 mg/mL，較陽性對照Vc高；具有較高的總還原能力，在 0.1 mg/mL時達到（1.20±0.01）mmol/L FeSO4，EC50為0.04 mg/mL。狹葉蕁麻醇提物在較高濃度時對透明質(zhì)酸酶的抑制率較高，在6.50 mg/mL時達到（93.14±0.08）%，IC50值為2.44 mg/mL；對白蛋白變性的抑制作用與陽性對照雙氯芬酸鈉相近，IC50分別為 0.31 mg/mL和 0.19 mg/mL。狹葉蕁麻醇提物中的活性物質(zhì)含量為：皂苷>黃酮>總酚>原花青素>生物堿。研究[27～29]表明，多酚類、黃酮類、原花青素類物質(zhì)具有抗氧化活性，皂苷類、原花青素類、生物堿類物質(zhì)具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用。由此可以看出，狹葉蕁麻醇提物所具有的抗氧化及抗炎活性為多種活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。