楊錫洪，辛榮玉，宋琳，李銀平，趙譽焜，石百媚，張俊逸，李鈺金，解萬翠

（1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島266042）（2.青島信和源生物科技有限公司，山東青島266002）（3.榮成泰祥食品股份有限公司，山東榮成 264303）（4.山東省冷凍調(diào)理食品加工技術(shù)企業(yè)重點實驗室，山東榮成 264309）

鎘是人體非必需的有害微量元素，廣泛存在于自然環(huán)境中，具有生物富集性，所以易在某些植物和動物體內(nèi)富集，最終通過食物鏈進(jìn)入人體。鎘在人體內(nèi) 的半衰期為10～35年[1]，長期接觸鎘會導(dǎo)致慢性中毒。研究證明鎘會引發(fā)腎、肝和肺等多個人體器官的損傷，并具有致癌和致畸作用[2]，日本著名的“骨痛病”事件便是由鎘中毒引起。競爭吸附法、酶－微生物分解法及亞臨界水處理法等[3]方法大都無法用于活體脫鎘，EDTA吸附法是目前較為有效的活體脫鎘方法。EDTA結(jié)構(gòu)中含有2個氨基氮原子和4個羧基氧原子，而這些原子都有孤對電子，根據(jù)有機(jī)結(jié)構(gòu)的張力學(xué)理論，五元環(huán)或六元環(huán)的張力最小，結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定[4]，在pH值合適時，EDTA螯合樹脂對鎘離子的吸附性能可達(dá)到最佳。但EDTA用于驅(qū)鎘時，會促使血液中Cd2+向肝臟、腎臟等臟器轉(zhuǎn)移，對機(jī)體無保護(hù)作用，加之本身具有一定的毒副作用，在慢性鎘中毒時，不宜采用EDTA治療[5]。

殼聚糖(Chitosan，CTS)是一種陽離子多糖，具有化學(xué)和機(jī)械修飾的結(jié)構(gòu)可能性[6]。因為CTS分子鏈上富含游離羥基及氨基，具有提供電子對的O和N，所以能有效與重金屬離子形成穩(wěn)定螯合物，可有效用于含重金屬離子工業(yè)廢水的處理、貴重金屬離子富集與回收等領(lǐng)域[7,8]。但是 CTS只能溶于一些稀的無機(jī)酸或有機(jī)酸中，不能直接溶于水中；且CTS在注射入體內(nèi)后能快速到達(dá)腎臟和尿液中，但幾乎不分布到肝、脾和血液等腎以外的組織，各種低分子量的CTS中，僅有殼二糖和殼三糖能被胃腸道略微吸收[9]，這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。

將EDTA接枝到CTS分子上，既可以改變CTS的溶解性差的缺點，又可以提高衍生物對重金屬的吸附性能，同時又能避免EDTA的毒副作用，提高了脫鎘劑的安全性。因此對CTS改性以制備一種水溶性及吸附性較好的吸附劑是近年研究的熱點[10]。Ren等[11]開發(fā)了一種新型磁性EDTA修飾CTS/SiO2/Fe3O4吸附劑 (EDCMS)， 在 pH 5.0（ 25 ℃ ） 下 ，CTS/SiO2/Fe3O4(CMS)對 Cu2+、Pb2+和 Cd2+最大吸附容量分別為31.680、9.324和4.496 mg/g，而在相同條件下EDCMS分別為44.736、123.491和63.281 mg/g，比較發(fā)現(xiàn)EDCMS對Cu2+、Pb2+和Cd2+的吸附性能比CMS強(qiáng)。REPO等[12]將EDTA或二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)的配體固定在 CTS的聚合物基質(zhì)上，發(fā)現(xiàn)制備的吸附劑對Co2+和Ni2+的吸附效率在93.6%～99.5%之間，吸附性能加強(qiáng)。REPO等[13]研究了EDTA配體對CTS與雜化材料進(jìn)行功能化合成新型吸附劑，發(fā)現(xiàn)合成的吸附劑結(jié)合了硅膠和CTS的優(yōu)點。

實驗動物的臟器重量和臟器系數(shù)是動物主要的生物學(xué)特性之一[14]。在藥物安全評價的長期毒性試驗中，動物臟器的重量常會出現(xiàn)一些變化。為了減小動物體重對臟器重量的影響，通常要計算實驗動物的臟器系數(shù)，比較不同劑量給藥組的臟器系數(shù)與對照組的差別，根據(jù)差別的顯著性檢驗動物的臟器是否受到不良影響[15]。小白鼠的基因序列和人類相似，它的全基因組和人類的相似度極高，很多人類難以治愈的疾病可以在小白鼠身上找到相似性狀，從而加以實驗發(fā)現(xiàn)致病基因。因此本文采用小鼠模型進(jìn)行脫鎘實驗，從而為人類脫鎘提供試驗基礎(chǔ)。

本文采用EDTA-Na2對CTS進(jìn)行?；男?，通過引入羧基以制備一種溶解性及吸附性均較 CTS好的殼聚糖衍生物，同時，小分子的EDTA鹽與CTS螯合后增加了安全性。通過蓄積及脫除實驗，從生物學(xué)水平研究ETC對鎘模型小鼠中Cd2+的吸附情況。為該類衍生物作用于人體以脫除重金屬提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明種小鼠由湛江422醫(yī)院動物中心提供（許可證號 SYXK(粵)2014-0053），體重 20～28 g；小鼠飼養(yǎng)溫度控制在20～26 ℃，自由采食、飲水；小鼠飼料、墊料由廣東醫(yī)學(xué)院提供。

殼聚糖(脫乙酰度≥90%，分子量50～60 ku，食品級)，江蘇南通綠神生物工程有限公司；EDTA-Na2、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)，上海源聚生物科技有限公司；羧甲基殼聚糖(CMCS)，浙江金殼生物化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo M6原子吸收分光光度計，賽默飛世爾科技公司；NEXUS-670紅外光譜儀，美國Nicolet公司；FDU-1100真空冷凍干燥機(jī)，埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司；YL300杯式超濾器，上海羽令過濾器材有限公司；mW800微波消解儀，加拿大aurora儀器(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ETC 制備

0.5 g CTS 加入到 50 mL 0.1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。加入 1 g EDTA-Na2[16]，并用 5 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)pH至5.5，再加入EDAC并使其終濃度為40 mmol/L；混合物室溫攪拌反應(yīng)16 h，反應(yīng)結(jié)束后透析，冷凍干燥即為成品[17]EDTA-CTS(ETC)。

1.3.2 ETC的FT-IR表征

ETC經(jīng)真空干燥后，用KBr混合壓片法，利用紅外光譜儀進(jìn)行表征。

1.3.3 ETC 取代度(DS)的測定

準(zhǔn)確稱量0.2 g在105 ℃烘干的ETC樣品，加入30 mL 0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?，?.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄pH值變化[18]。

注：DS為EDTA在CTS上取代度[19]；0.157為EDTA取代占衍生物比值；?V為兩個突變點之間消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；M為氫氧化鈉溶液的濃度（mol/L）；W為樣品的凈重（g）。

1.3.4 ETC的熱分析

通過熱重、差示量熱掃描(TG-DSC)分析研究ETC衍生物的熱穩(wěn)定性[20]。

1.3.5 小鼠體內(nèi)重金屬鎘的蓄積

1.3.5.1 連續(xù)染毒方法

對照組：腹腔注射生理鹽水（10 mL/kg），每1 d注射一次，共注射6次。

染毒組：將小鼠腹腔注射 CdCl2溶液（鎘 1 mg/kg），每1 d染毒一次，共染毒6次，染毒結(jié)束1 d后，活體摘除眼球取血，處死小鼠取各臟器，消化檢測Cd2+含量。

1.3.5.2 間隔染毒方法

對照組：腹腔注射生理鹽水(10 mL/kg)，隔2 d 注射一次，共注射3次。

染毒組：將小鼠腹腔注射CdCl2溶液(鎘1 mg/kg)，隔2 d染毒一次，共染毒三次，染毒結(jié)束1 d后處死小鼠，其他同1.3.5.1[21,22]。

1.3.6 小鼠脫毒實驗

將上述染毒組小鼠隨機(jī)分成8組，分別為空白對照組、染毒對照組、EDTA治療組、ETC低劑量治療組(0.0731 g/kg)、ETC 中劑量治療組(0.1461 g/kg)、ETC高劑量治療組(0.2922 g/kg)、CTS 治療組(0.2922 g/kg)、羧甲基殼聚糖治療組(CMCS 0.2922 g/kg)[23]。以灌胃的方式脫毒處理6 d，治療結(jié)束后1 d處死小鼠。

1.3.7 小鼠處理及體內(nèi)重金屬含量的檢測

1.3.7.1 小鼠血樣中鎘含量

小白鼠進(jìn)行活體摘除眼球取血0.5 mL，血樣用石墨爐原子吸收光譜儀測定血鎘含量。同時做試劑空白[24,25]。

1.3.7.2 染毒小鼠臟器中的鎘含量

末次給藥治療后1 d處死小鼠，取心，肝，腎臟器。

用生理鹽水清洗表面血污，濾紙吸干表面水分，稱重。計算實驗動物臟器的重量與其體重之比，即臟器系數(shù)[26]，計算公式如下：

然后進(jìn)行消化后，采用原子吸收分光光度法[27]檢測肝臟、腎臟、及心的鎘含量。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 ETC的紅外表征及熱分析

2.1.1 衍生前后的FT-IR表征

圖1 CTS及ETC的FT-IR圖譜Fig.1 FT-IR spectra of chitosan and ETC

經(jīng)酸堿滴定法計算，本實驗合成的ETC的取代度為0.4，即2.5個糖單體上?；粋€EDTA分子。CTS及其衍生物ETC的FT-IR圖譜如圖1所示。CTS的紅外光譜中3422 cm-1是-OH和-NH2的伸縮振動峰，1597 cm-1為 N-H 的面內(nèi)彎曲振動(酰胺Ⅱ)，1380 cm-1為N-H的面外彎曲振動(酰胺III)[29～31]。與CTS不同的是，ETC在1401 cm-1處較強(qiáng)的特征峰為羧基的對稱伸縮振動峰，說明產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中羧基含量較多，1628 cm-1處為酰胺基中的C=O特征峰，同時在1597 cm-1處游離氨基的吸收峰消失，證明EDTA在CTS的C2位上的伯氨基發(fā)生?；磻?yīng)；而從ETC的紅外光譜圖中觀察不到 C6位上的伯羥基酰化生成的酯的特征峰，證明CTS C2位的氨基上發(fā)生?；磻?yīng)[32]。圖中結(jié)構(gòu)式為EDTA-CTS結(jié)合物的推定結(jié)構(gòu)，絡(luò)合劑的共價連接通過構(gòu)成聚合物的伯氨基與EDTA的羧酸基團(tuán)的酰胺結(jié)合來實現(xiàn)[33]。

2.1.2 CTS及ETC的TG-DSC分析

圖2 CTS與EDTA-CTS的TG-DSC圖譜Fig.2 TG-DSC curves of chitosan and ETC

CTS與ETC的TG-DSC圖譜如圖2所示。由圖2可知，在DSC圖譜中，CTS和ETC在升溫受熱情況下有兩個吸熱峰，前面的是其失去吸附水后產(chǎn)生的吸熱峰，而308.27 ℃和277.12 ℃為主鏈斷裂所產(chǎn)生，ETC中該峰向低溫移動約20 ℃，說明衍生化后糖鏈斷裂所需能量降低[34]。從熱重圖譜可知，隨著溫度的升高，ETC和CTS都有2個熱失重階段，第一階段發(fā)生在100 ℃之前，此階段失重較小，主要是樣品中的結(jié)合水與結(jié)晶水的蒸發(fā)。第二個階段發(fā)生在250～350 ℃之間，此階段失重較大，說明此時CTS及殼聚糖衍生物都熱降解劇烈。兩者不同之處是，ETC在100 ℃之前熱失重率較大，約為10%，表明產(chǎn)物含水較高；第二熱失重階段，ETC降解溫度范圍較寬，且熱失重率較小，表明具有比CTS較高的熱穩(wěn)定性。

2.2 小鼠體內(nèi)重金屬鎘的蓄積

通過對小鼠連續(xù)染毒及間接染毒兩種方式染毒，結(jié)束后1 d處死小鼠，測定小鼠血、心、肝和腎的鎘含量見表1。從表1可以看出，小鼠經(jīng)染毒后，在小鼠的四部位鎘含量都發(fā)生明顯的變化(p＜0.01)，都明顯的增加，其中連續(xù)染毒的血鎘含量甚至到達(dá) 202.50 μg/L，是空白組的200倍以上，連續(xù)染毒與間接染毒的小鼠血液中的含量最高，分別為202.50 μg/L，108.21 μg/L；其次為肝，分別為 72.26 μg/g，25.70 μg/g，證明染毒成功。從數(shù)據(jù)中可判斷出連續(xù)染毒中各部分的鎘含量都比間接染毒要多，說明連續(xù)染毒對小鼠的毒害作用比間接染毒強(qiáng)，其原因在于連續(xù)注射（6次）的總劑量遠(yuǎn)高于間隔注射（3次），連續(xù)染毒小鼠體內(nèi)富集的鎘含量明顯高于間接染毒；連續(xù)染毒中肝的鎘含量是間接染毒中鉻含量的3倍，增大倍數(shù)明顯大于其他器官，這可能是由于小鼠的肝解毒功能，使間接染毒的小鼠中鎘含量在一定程度上明顯降低。

表1 染毒小鼠鎘含量Table 1 The cadmium contents in toxic mice(±s)

表1 染毒小鼠鎘含量Table 1 The cadmium contents in toxic mice(±s)

注：血鎘含量單位為(μg/L)，臟器鎘含量單位(μg/g)，濕重計。與空白組相比，##p＜0.01。

組別 檢測部位 連續(xù)染毒 血 心 肝 腎 空白組 1.420±0.080 0.041±0.003 0.017±0.004 0.040±0.006 染毒組 202.500±6.620## 1.720±0.008## 72.260±3.910## 19.980±0.280## 組別 檢測部位 間接染毒 血 心 肝 腎 空白組 1.395±0.110 0.038±0.001 0.041±0.003 0.035±0.008 染毒組 108.210±4.500## 0.830±0.008## 25.700±0.330## 6.592±0.040##

表2 兩種染毒方式對小鼠體重的影響Table 2 The effect of two exposure ways on body weight of mice(±s)

表2 兩種染毒方式對小鼠體重的影響Table 2 The effect of two exposure ways on body weight of mice(±s)

注：間接染毒與相應(yīng)的連續(xù)染毒組比較，#p＜0.05，##p＜0.01；相同染毒方式與染毒前1天比較，*p＜0.05，**p＜0.01；單位(g)。

組別 連續(xù)染毒 間隔染毒 染毒前1 d 染毒開始后第8 d 染毒前1 d 染毒開始后第8 d 空白對照組 21.81±1.67 24.25±3.19 24.50±3.08 28.00±1.55#* 鎘對照組 21.69±2.25 22.68±1.44 23.67±2.58 27.20±1.30##** EDTA治療組 22.07±2.01 23.73±1.56 21.83±2.85 26.50±3.33** ETC低劑量治療組 20.73±2.17 23.33±1.91 23.33±2.58 27.33±3.01#* ETC中劑量治療組 21.59±2.22 23.53±2.54 21.33±1.03 26.33±2.16#** ETC高劑量治療組 21.34±4.84 22.55±3.55 22.83±2.48 26.50±1.22 CTS治療組 23.65±2.68 23.94±4.36 23.00±2.68 26.33±1.75 CMCS治療組 21.58±2.81 21.61±4.29 22.17±2.22 26.33±2.58#*

2.3 不同給藥及劑量對小鼠體重的影響

兩種染毒方式對小鼠體重的影響見表2數(shù)據(jù)。從表2可知，連續(xù)染毒法處理組體重都低于空白對照組，雖然無顯著性差異，也可說明連續(xù)染毒對小鼠體重的增長起到了一定的抑制作用，在間隔染毒法中，染毒開始后第8 d的小鼠體重均增加，且EDTA治療組、ETC低、中劑量治療組、CMCS治療組具有顯著性差異(p＜0.05 或p＜0.01)。在連續(xù)染毒 8 d 后，CMCS 治療組小鼠體重明顯降低，具有顯著性差異(p＜0.05)。間隔染毒各組之間與相應(yīng)的連續(xù)染毒組相比，大都具有顯著性，說明兩種染毒方式對動物產(chǎn)生的急性毒性作用有一定的差別，這與朱圣陶等[35]的研究結(jié)果相似，他認(rèn)為小鼠對隔日染毒具有較大的耐受性，動物可在短期時間內(nèi)對重金屬代謝，使其生長不出現(xiàn)抑制。

2.4 驅(qū)鎘劑治療后小鼠臟器系數(shù)的變化

圖3 不同染毒方式對小鼠臟器系數(shù)的影響Fig.3 Effects of different exposure modes on organ coefficient in mice

以連續(xù)和間隔染毒的不同染毒方式對小鼠臟器系數(shù)的影響，如圖3所示。從圖3可以看出兩種染毒方式對小鼠臟器系數(shù)的影響相似，小鼠經(jīng)鎘染毒并解毒后，鎘對照組與空白對照組相比，注射金屬鎘可導(dǎo)致小鼠心臟系數(shù)增大，而對肝臟及腎臟系數(shù)影響不大。連續(xù)染毒方式中，ETC低劑量、ETC高劑量治療組、CTS治療組、CMCS治療組與鎘對照組相比，心臟系數(shù)均降低且具有顯著差異性(p＜0.05或p＜0.01)；間隔染毒中，EDTA治療組、ETC低劑量組、CMCS治療組較鎘對照組心臟系數(shù)顯著降低，說明驅(qū)鎘劑的加入能使鎘中毒引起升高的心臟系數(shù)降低。兩種染毒方式對小鼠肝臟、腎臟系數(shù)的影響相似，表明本實驗所用金屬鎘溶液染毒劑量對動物心臟系數(shù)有影響，而對肝臟和腎臟系數(shù)無明顯影響。這可能與肝臟與腎臟是排毒器官有關(guān)。

2.5 脫鎘劑治療后小鼠血鎘含量檢測

以不同類型及劑量的脫鎘劑進(jìn)行脫除后，測得各組小鼠的血鎘含量如表3所示。從表3可以看出，在對小鼠先進(jìn)行染毒后進(jìn)行脫除后發(fā)現(xiàn)，各治療組與鎘對照組相比血鎘含量均降低，差異具有顯著性(p＜0.01)，說明驅(qū)鎘劑的加入，對小鼠體內(nèi)鎘的脫除起到了一定作用，從而使血液中的鎘含量降低。尤其是在加入EDTA脫鎘劑后，與鎘對照組血樣中的鎘含量相比，血樣中的鎘含量濃度差距最大，但在血樣中的含量也是最少的，這可能由于在確定 ETC的計量組時，并沒有使用最佳脫鎘濃度，而EDTA治療組正好處于最佳脫鎘濃度，導(dǎo)致最終在加入EDTA后血樣中鎘含量最少。

表3 各組小鼠血鎘含量Table 3 The concentration of the blood cadmium of every group mice(±s)

表3 各組小鼠血鎘含量Table 3 The concentration of the blood cadmium of every group mice(±s)

注：與空白組相比，#p＜0.05，##p＜0.01；與鎘對照組相比，*p＜0.05。

組別 連續(xù)染毒 間隔染毒 血樣/(μg/L) 血樣/(μg/L) 空白組 1.498±0.509 1.387±0.098 鎘對照組 186.500±28.770## 89.700±6.410## EDTA治療組 83.140±23.350##** 48.960±2.381#** ETC低劑量治療組 103.400±29.680##** 66.100±1.203##**ETC中劑量治療組 97.850±2.731##** 50.320±0.850#** ETC高劑量治療組 97.860±15.830##** 53.010±1.205#** CTS治療組 126.700±14.460##** 66.980±0.296##**CMCS治療組 127.130±4.180##** 77.320±3.108##**

2.6 脫鎘劑治療后小鼠各臟器鎘含量變化

通過對動物小鼠的鎘建模實驗，染毒組的小鼠各臟器中鎘的含量與空白對照組相比均升高，且均具有顯著性差異(p＜0.01)。以不同脫鎘劑對小鼠各臟器進(jìn)行脫毒，脫毒后鎘含量的變化如圖4所示。從圖4可知，連續(xù)染毒方式中，EDTA與CTS治療組除外，其余各治療組各臟器鎘含量與鎘對照組相比均減少，并具有顯著性差異(p＜0.01)，CTS治療組與鎘對照組相比，心、肝鎘含量均降低，并有顯著性差異(p＜0.01)，EDTA治療組雖然對各臟器鎘含量有降低作用，但是無顯著性差異。間隔染毒方式中，除CTS治療組外，其余各治療組與鎘對照組相比小鼠各臟器鎘含量均較少，并有顯著性差異(p＜0.01)。

圖4 不同脫鎘劑對小鼠臟器鎘含量的影響Fig.4 Effect of Different Cadmium Removal Agents onCadmium Contents in Mice

4種脫除方法中，ETC衍生物高劑量組相對于ETC中劑量組、ETC低劑量組對鎘脫除動物小鼠體內(nèi)的臟器鎘含量效果更好。CTS脫重金屬能力增強(qiáng)的原因在于，殼聚糖通過在O-位引入外來基團(tuán)，不僅保留了氨基，使N的孤對電子能更多重金屬離子形成配位鍵，且引入的基團(tuán)又可進(jìn)一步增強(qiáng)殼聚糖的吸附能力[36]。

3 結(jié)論

3.1 通過 EDTA 對 CTS改性，制得殼聚糖衍生物ETC。然后以不同的染毒方式進(jìn)行Cd2+的蓄積及脫除。兩種染毒方式都會使鎘對照組心臟系數(shù)均增大，并有顯著差異性。ETC低、高劑量組、CTS治療組、CMCS治療組與鎘染毒組相比，心臟系數(shù)均降低，脫鎘劑對重金屬有一定的驅(qū)除作用。

3.2 EDTA、ETC、CTS對血鎘脫除率分別達(dá)58.94%、51.68%、37.43%；而 ETC對小鼠臟器鎘的脫除率遠(yuǎn)高于其他脫鎘劑，其中對心、腎鎘脫除率分別高達(dá)63.90%、45.00%，得出ETC對小鼠體內(nèi)重金屬Cd2+有較好的吸附作用。

3.3 目前鎘污染已經(jīng)越來越嚴(yán)重，無論是陸地、海洋還是人體的重金屬超標(biāo)現(xiàn)象也越來越嚴(yán)重。就現(xiàn)在來看，大多數(shù)重金屬脫除劑會對人體、海洋動物等產(chǎn)生各種副作用，導(dǎo)致人體、動物的臟器受損嚴(yán)重，因此人類、動物急需一種天然、無毒、高效的脫鎘劑來脫除其身體中的重金屬鎘。而本文所制備的改性殼聚糖，能在一定程度上克服了CTS的難溶于水的缺點，而且高效、無毒，為以后人類去除水中的重金屬Cd2+及其他有毒、有害的離子提供了一條新思路。