賈愛娟，周凱，孫遠明，徐振林，陳元佳，韋曉群

（1.廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東中山 528437）（2.廣東省食品質量安全重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）

氨基甲酸乙酯(EC)，又稱尿烷，是一種廣泛存在于發(fā)酵食品中的 2A級致癌物(國際癌癥研究機構，2007年)，能夠直接導致人類產(chǎn)生肝癌[1,2]，主要在發(fā)酵、蒸餾、滅菌和貯藏等過程形成[3]。早在 2002年EC被聯(lián)合國糧農(nóng)組織納入重點監(jiān)控物質，推薦發(fā)酵食品中EC含量不超過20 μg/L[4]。在我國和其他一些 亞洲國家，發(fā)酵醬油是一類重要的食品調味料[5]，Park在研究中指出，醬油是攝入EC的主要發(fā)酵食品，雖然致癌風險較低，但對于長期大量食用人群，需要保持警惕[6,7]。因此迫切需要準確了解發(fā)酵醬油中EC主要前體物質，并對形成主要前體物質的因素進行有效控制。

歷年來廣東是我國醬油的主要生產(chǎn)和出口地區(qū)[8]。以“日曬夜露”特色生產(chǎn)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油因其發(fā)酵時間長風味醇香而成名。然而，由于獨特的原料和發(fā)酵方式，很容易形成大量EC。醬油中EC的主要前體物質是酒精和瓜氨酸[9]，分別在酵母發(fā)酵階段和乳酸菌發(fā)酵階段大量產(chǎn)生[10]。由于酒精有助于醬油獨特的醬香風味，控制EC的方法主要集中于控制瓜氨酸形成[11]。瓜氨酸是一種非蛋白質氨基酸，主要由微生物通過精氨酸脫氨基途徑(ADI)形成[1]。ADI途徑只存在與少數(shù)原核生物中，醬油中的魯氏結合酵母并不能產(chǎn)生瓜氨酸[12]。在醬油發(fā)酵過程中，前期發(fā)酵的曲霉以及隨后使發(fā)酵液pH降低的乳酸菌可能成為瓜氨酸的主要來源。Zhang認為[10]，Pediococcus acidilactici是醬油中瓜氨酸的主要來源，但在醬油發(fā)酵過程中，Weissella和Candida是優(yōu)勢菌株[13]。因此有必要深入了解醬油中的Weissella消耗精氨酸積累瓜氨酸的情況。

本研究以高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油為主要研究對象，分離了醬油乳酸發(fā)酵階段乳酸菌，確定了對瓜氨酸積累情況，并考察了環(huán)境因素Weissella confusa積累瓜氨酸的影響。為尋求有效的方法降低醬油中瓜氨酸積累，減少醬油中EC的產(chǎn)生提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

醬油曲料、醬醪和醬油發(fā)酵液來源于廣東美味鮮調味食品有限公司和番禺東海調味食品有限公司兩個醬油制造廠，均為高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油，原料取回后均保存于4 ℃冰箱。

氨基甲酸乙酯(EC，99%)、9-占噸醇(98%)、氨基甲酸丁酯(BC，98%)、尿素(99%)、巴比妥酸、吡啶均為分析純，購買于上海阿拉丁試劑公司。乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷為色譜純，購買于RCI Labscan公司(泰國)。氫氧化鈉、無水硫酸鈉和鹽酸等其他常用試劑購買于天津希恩思生化有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基甲酸乙酯的測定

氨基甲酸乙酯的分離和檢測參考國標中5009.223-2014并稍作修改，采用VF-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱，氣相色譜質譜型號為 Agilent 7890A-5975C(美國)，色譜參數(shù)設置為：氦氣為載氣，流速為1.0 mL/min進樣口溫度為220 ℃，氣體洗脫程序設置為初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min加熱至180 ℃后再以40 ℃/min加熱至240 ℃，保持5 min，不分流進樣，進樣量為1.0 μL。質譜參數(shù)設定為：采用點噴霧離子源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃采用SIM模式掃描，特征離子為62、74和89，為了提高靈敏度選擇62為定量離子。

樣品前處理參考國標5009.223-2014和Huang[14]并稍做修改。量取2 mL醬油及其發(fā)酵液并加入100 μL BC內標(1 μg/mL)混合均勻，EC提取和純化采用固相萃取法，使用CNWBOND固相萃取小柱(上海安普)，先用正己烷潤洗，將樣品溶液加入萃取柱中，靜置10 min，用正己烷淋洗后，再用乙酸乙酯-乙醚(V/V=5:95)洗脫。將上述所得的萃取液和洗脫液收集到離心管后用氮吹儀濃縮至干，采用二氯甲烷后充分混勻溶解后定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm的有機濾膜后供GC-MS分析。

1.2.2 尿素和pH測定

尿素含量采用輕工業(yè)行業(yè)標準 QB/T 4710-2014進行測定，取稀釋后的樣品600 μL，加入400 μL的9-羥基噸氫醇(0.02 mol/L，溶于正丙醇)衍生化試劑，并加入 100 μL 1.5 mol/L 的鹽酸溶液，漩渦震蕩 1 min，避光在 25 ℃下反應 30 min，反應液經(jīng) 0.45 μm 有機濾膜過濾后供高效液相色譜法色譜結合熒光檢測器分離檢測。以保留時間定性，采用峰面積外標法定量。色譜柱選擇ZORBAX SB-C18柱，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。熒光檢測器激發(fā)波長為240 nm，發(fā)射波長為308 nm。采用PHS-25型pH計測定發(fā)酵液的pH值，測定前將發(fā)酵液放置于25 ℃水浴中放置20 min使溫度達到平衡。

1.2.3 瓜氨酸和精氨酸測定

瓜氨酸和精氨酸的含量參考 Zhou[15]的方法利用分光光度法稍加修改。精氨酸測定：將40 g/L NaOH、80 g/L甲萘酚和0.5 mL/L雙乙酰(用正丙醇溶解)各1 mL加入10 mL比色管中，然后加入100 μL適當稀釋的樣品(或標準溶液)，混勻后在 30 ℃水浴中保溫 15 min，冷卻室溫后測OD540，對應標準曲線中計算出精氨酸含量。瓜氨酸測定：將2 mL稀釋的樣品加入1 mL混合酸(V/V=1:3)，加入 30 g/L 二乙酰一肟 0.125 mL，混勻后避光沸水浴 30 min，繼續(xù)避光冷卻室溫后側OD490，對應標準曲線中計算出瓜氨酸含量。

1.2.4 醬油中乳酸菌的分離和鑒定

將發(fā)酵醬醪用0.85%的生理鹽水梯度稀釋，取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基中并置30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至有單菌落出現(xiàn)，將外觀不同的菌落挑出并劃線純化數(shù)次，用20%的甘油保存于-80 ℃冰箱中。將純化的菌株培養(yǎng)至OD600為1時分別接種至兩種含有和不含18%NaCl的改良MRS液體培養(yǎng)基(加入了10 g/L精氨酸)中，置于30 ℃培養(yǎng)24 h。離心后測定上清液中瓜氨酸和精氨酸含量。細菌基因組DNA提取試劑盒(天根)步驟提取分離得到的菌株細菌基因組產(chǎn)物并送北京睿博興科生物技術有限公司進行16s rDNA測序分析。并在 National Center for Biotechnology Information數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上在線比對。

1.2.5Weissella confusa積累瓜氨酸的規(guī)律

挑選一株能夠大量積累瓜氨酸的Weissella confusa，分別接種至 50 mL的兩種含有和不含18%NaCl的改良MRS液體培養(yǎng)基(加入了10 g/L精氨酸)，不含有 18%NaCl的培養(yǎng)基在 30 ℃中靜置培養(yǎng)24 h，含有18%NaCl的培養(yǎng)基在30 ℃中靜置培養(yǎng)48 h，分別定時取樣測定OD值和上清中的精氨酸和瓜氨酸含量。將該菌株培養(yǎng)至 8 log cfu/mL 后取 1 mL 接種至9 mL改良的MRS培養(yǎng)基(含10 g/L精氨酸)中：不同的 NaCl濃度 6%、9%、12%、15%和 18%；不同pH 4、4.6、5.4、6.2；不同葡萄糖 0、20、40、80 g/L；不同尿素添加量5、10、20、40 mg/L；不同乙醇含量0.5%、1%、2%、4%。培養(yǎng)結束后測定上清液中精氨酸與瓜氨酸含量。其中不同pH組外，其余實驗組均通過乙酸將pH調節(jié)至為6.2。除了不同的NaCl濃度組需要在 30 ℃培養(yǎng) 48 h，其他組均培養(yǎng) 24 h。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗分別重復三次。采用 SPSS statistics 19分析軟件中的ANOVA程序對結果進行差異性顯著分析。所有數(shù)據(jù)作圖均采用origin 8.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 醬油發(fā)酵過程中EC與前體物質生成情況

圖1 醬油發(fā)酵過程中EC與尿素和瓜氨酸的相關性Fig.1 The relative of EC with urea and cirtulline during soy sauce fermentation

通過對番禺和中山兩個醬油廠的醬油發(fā)酵液中的EC含量進行監(jiān)控，同時也在實驗室模擬醬油發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)EC在整個醬油發(fā)酵階段含量非常低(低于8 μg/L)。通過對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中EC與瓜氨酸相關性較高，相關系數(shù)達0.72，而尿素與EC的相關性很低(無法擬合，圖1)。雖然醬油中EC大量形成于淋油和滅菌階段[16]，但主要EC前體物質瓜氨酸卻在發(fā)酵前期的乳酸發(fā)酵過程中大量積累[10,17]。EC最早出現(xiàn)在pH約為4.8時(圖1圓圈處)，此時乳酸發(fā)酵臨近結束，乙醇開始積累。在此過程中，醬油中的主要微生物為曲霉和乳酸菌。由于未在醬油曲料中檢測到EC和瓜氨酸，因此認為曲霉新陳代謝并不能提供形成EC的主要前體物質瓜氨酸。

2.2 乳酸菌分離與瓜氨酸積累情況

圖2 醬油中分離的乳酸菌在不含(a)和含有(b)18%NaCl的MRS培養(yǎng)基(含10 g/L精氨酸)培養(yǎng)24 h后利用精氨酸積累瓜氨酸的能力Fig.2 The arginine consumption and citrulline accumulation capacity of lactic acid bacteria isolated from the high-salt liquid-state fermented soy sauce

利用MRS固體培養(yǎng)基分離pH約為4.8中的醬醪中乳酸菌，通過對比菌落特征共得到34株菌，菌株鑒定結果與Sulaiman基本一致[13]。圖2顯示分離得到的乳酸菌在含有和不含18%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中利用精氨酸積累瓜氨酸的情況。顯然 18%NaCl脅迫下，乳酸菌積累瓜氨酸能力顯著提高[10]，精氨酸到瓜氨酸的轉化率提高了 1～14倍。根據(jù)能否大量利用和基本不利用精氨酸將得到的乳酸菌大致分成兩類，基本不能利用精氨酸的菌株全部為Leuconostoc garlicum，這類乳酸菌雖然在含有與不含18%NaCl的培養(yǎng)基中均具有較高的瓜氨酸轉化率，但利用精氨酸能力均很差，積累瓜氨酸能力很有限，即使在18%NaCl的脅迫下，積累的瓜氨酸含量均沒有超過140 mg/L。另一類能大量消耗精氨酸，根據(jù)積累瓜氨酸情況也分成兩類：一類積累少量瓜氨酸，主要為Weissella confusa(5號和34號)、Weissella cibaria、Enterococcus faecium、Weissella sp和Bacillus velezensis。另一類是大量積累瓜氨酸的菌株，主要有Pediococcus acidilactici、Weissella confusa、Leuconostoc sp、Sphingomonas echinoides和Rummeliibacillus stabekisii。其中Pediococcus acidilactici能夠在 18% NaCl的培養(yǎng)基積累最多的瓜氨酸(1682 mg/L)，且轉化率達到17.18%，但數(shù)量很少。Weissella confusa檢出數(shù)量最多，均能大量利用培養(yǎng)基中的精氨酸，但積累瓜氨酸的能力差別很大，其中5和34號的Weissella confusa在不含NaCl的培養(yǎng)基中利用精氨酸能力很差但在18% NaCl的培養(yǎng)基中能高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸，而除5和34號的其他Weissella confusa在MRS培養(yǎng)基中均能大量利用精氨酸，在高含量的NaCl脅迫下積累瓜氨酸能力顯著提高。

2.3Weissella confusa生長過程中對瓜氨酸積累情況

圖3 Weissella confusa在不含(a)和含有(b)18%NaCl的MRS(10 g/L精氨酸)培養(yǎng)基中消耗精氨酸和利用瓜氨酸的情況Fig.3 The arginine consumption and citrulline accumulation ability of Weissella confusa in cultivating with (a) and without(b) 18%NaCl MRS Medium

圖3是將挑選的一株Weissella confusa在最佳外界條件下培養(yǎng)，分別在不同時間內測定上清液中精氨酸和瓜氨酸的情況。由圖可以看出，在沒有18%NaCl脅迫下，Weissella confusa在對數(shù)生長期對精氨酸消耗量急劇增加，一方面能夠滿足菌體自身新陳代謝和繁殖，一方面利用ADI途徑產(chǎn)物減緩環(huán)境pH值的降低[18]。由于環(huán)境適合，精氨酸含量高，精氨酸到瓜氨酸的轉化率在對數(shù)生長期變化較小，而在培養(yǎng)24 h后，上清液瓜氨酸含量才顯著升高。而18%NaCl脅迫顯著抑制了Weissella confusa生長，瓜氨酸在整個生長過程中均在積累，且轉化率都在20%以上。研究認為[15]，鹽是導致細胞內arcB基因轉錄水平相對于arcA減少從而造成瓜氨酸轉化率提高。而瓜氨酸的釋放機制卻不清楚。在本實驗室，推測瓜氨酸在沒有鹽脅迫下主要由后期細胞衰亡過程中釋放到環(huán)境中從而積累，在有高濃度鹽脅迫下，積累的瓜氨酸能夠持續(xù)的釋放至細胞外。

2.4 環(huán)境因素對魏斯氏菌株積累瓜氨酸的影響

分別考察了鹽、pH、葡萄糖、乙醇和尿素含量對Weissella confusa消耗瓜氨酸積累精氨酸的影響。結果顯示NaCl添加量是Weissella confusa轉化率超過10%的唯一因素，也是積累瓜氨酸的最主要的因素，這也和P. acidilactici結果一致[10]，但是，NaCl添加量為9%時，雖然精氨酸消耗量與6%NaCl時相近，但此時瓜氨酸顯著增加至最大，轉化率也為最高的58.5%。隨后隨著鹽濃度的增加，Weissella confusa生長受到抑制，消耗精氨酸能力下降，轉化率也隨之下降，但在18%NaCl(醬油發(fā)酵時含鹽量)的培養(yǎng)基下，轉化率升高但瓜氨酸積累依然降低，此時瓜氨酸積累量為1333.54 mg/L。Weissella confusa在含12%～18% NaCl培養(yǎng)基下最終菌的數(shù)量基本一致，但精氨酸到瓜氨酸轉化率在15%NaCl時最小，此時單位菌體利用精氨酸能力不是最弱，但消耗瓜氨酸能力強。

圖4 Weissella confusa在不同條件下消耗精氨酸和利用瓜氨酸的情況Fig.4 The ability of Weissella confusa to consume arginine and accumulate citrulline in different conditions

推測在該鹽濃度對Weissella confusa的ADI途徑中精氨酸脫亞氨基酶(ADI酶)抑制強于12%NaCl，但對鳥氨酸轉氨甲酰基酶(OTC酶)抑制又弱于18%NaCl，導致此時ADI/OTC酶活比例降至最低[12]，因此15%鹽濃度可做為降低Weissella confusa精氨酸到瓜氨酸轉化率的重要因素之一。在pH為4.8時，Weissella confusa消耗精氨酸能力最強轉化率也最高，這也和分離的醬醪pH一致，且為該菌積累瓜氨酸的最佳pH，但在pH為4時，Weissella confusa生長受到抑制，轉化率不到1%。

葡萄糖對Weissella confusa積累瓜氨酸影響較大，雖然糖代謝和精氨酸的代謝相互獨立，但實驗顯示高濃度的葡萄糖能夠提高精氨酸到瓜氨酸的轉化率和瓜氨酸濃度，可能的原因是：(a)提高了菌株生長速率，使得穩(wěn)定期提前；(b)也可能是影響了環(huán)境的 pH，從而影響菌體的轉化率[19]；(c)葡萄糖氧化形成的大量ATP抑制了ADI途徑在酸拮抗下產(chǎn)生ATP，導致瓜氨酸的積累[20]。由于醬油發(fā)酵時乙醇含量和尿素含量很低，這兩者對Weissella confusa消耗精氨酸與積累瓜氨酸均沒有顯著影響。在2%乙醇濃度和10%的尿素存在下，精氨酸到瓜氨酸的轉化率為最高。

3 結論

3.1 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油在發(fā)酵過程中EC最早出現(xiàn)在發(fā)酵液pH為4.8時，此時瓜氨酸大量積累，整個發(fā)酵過程中EC與瓜氨酸的相關性遠高于尿素，證實了瓜氨酸才是醬油中主要的EC前體物質。制曲過程沒有檢測到瓜氨酸積累和EC形成。

3.2 分離得到的乳酸菌主要分成三類。一類是不能大量消耗精氨酸同時瓜氨酸積累量很小，全部是Leuconostoc garlicum；另外兩類能大量消耗精氨酸，但積累瓜氨酸能力差異很大，除了先前報道的Pediococcus acidilactici能大量積累瓜氨酸外，Weissella confusa是分離得到的優(yōu)勢菌株，大部分能夠在18%NaCl培養(yǎng)基中大量積累瓜氨酸。

3.3 鹽脅迫是Weissella confusa積累瓜氨酸的主要因素，在含18%NaCl培養(yǎng)基中在生長過程中不斷積累。Weissella confusa在9%NaCl存在下，精氨酸到瓜氨酸的轉化率達到最高，瓜氨酸積累最多。pH 4.8和高濃度的葡萄糖能夠提高精氨酸到瓜氨酸的轉化率并積累更多的瓜氨酸。因此，消除此類乳酸菌在鹽脅迫下積累瓜氨酸的能力或將產(chǎn)生的大量瓜氨酸轉化掉將有助于高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中EC含量控制。