劉明 劉楊 張永萍 徐劍 孫宜春 白志文

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1201-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.12

摘 要 目的：研究新仙靈骨葆膠囊對大鼠骨折愈合的影響，為尋求“減量增效（減量等效）”新組方提供參考。方法：將大鼠隨機分為假手術(shù)組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）、仙靈骨葆膠囊組（350 mg/kg）和新仙靈骨葆膠囊低、中、高劑量組（53、105、210 mg/kg），每組14只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均在麻醉狀態(tài)下制作右側(cè)股骨中段骨折模型。待大鼠術(shù)后清醒，各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物10 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)4周。末次給藥后，測定大鼠體質(zhì)量，觀察骨折處骨痂形成及組織病理學(xué)變化，進行骨折側(cè)生物力學(xué)（骨折應(yīng)力、骨壓碎力）測量，并采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）] 水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和骨折側(cè)骨折應(yīng)力、骨壓碎力明顯降低（P<0.05或P<0.01），血清中TNF-α、IL-1β水平明顯升高（P<0.01）；模型組大鼠骨折周圍可見明顯骨痂形成，骨小梁不成熟、排列混亂。與模型組比較，新仙靈骨葆膠囊高劑量組和仙靈骨葆膠囊組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.05），新仙靈骨葆膠囊中、高劑量組和仙靈骨葆膠囊組大鼠骨折側(cè)骨折應(yīng)力明顯升高（P<0.05或P<0.01），各給藥組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平均明顯降低（P<0.01）；且新仙靈骨葆膠囊各劑量組與仙靈骨葆膠囊組比較上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各給藥組大鼠骨痂面積均變小，骨折線變模糊，骨折痕跡基本消失，骨小梁數(shù)量增多；骨折處皮質(zhì)層增厚，骨髓腔見大量毛細血管植入。結(jié)論：新仙靈骨葆膠囊具有明顯的促進骨折愈合作用，可有效提高骨生物力學(xué)強度，抑制炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 新仙靈骨葆膠囊；大鼠；骨折；骨生物力學(xué)；炎癥因子

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of new Xianling gubao capsule on fracture healing in rats， and to provide reference for seeking new formula of “to reduce stockpiles and increase efficiency （to reduce stockpiles and constant efficiency）”. METHODS： Rats were randomly divided into sham operation group （distilled water）， model group （distilled water）， Xianling gubao capsule group （350 mg/kg）， new Xianling gubao capsule low-dose， medium-dose and high-dose groups （53， 105， 210 mg/kg）， with 14 rats in each group. Except for sham operation group， right middle femur fracture model was established under the anesthetic state. Rats were given relevant medicine 10 mL/kg intragastrically after woken， once a day， for consecutive 4 weeks. After last administration， body weights of rats were determined； the formation of callus and histopathological changes in fracture were observed； biomechanics of fracture side （fracture stress and bone crushing force） was measured. The levels of inflammatory factors （TNF-α， IL-1β） in serum were detected by ELISA. RESULTS： Compared with sham operation group， body weight， fracture stress and bone crushing force of fracture side were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the serum levels of TNF-α and IL-1β were increased significantly （P<0.01）. In model group， the scab was visible around the fracture， and the trabecular bone was not mature and arranged in confusion. Compared with model group， body weights of rats were increased significantly in new Xianling gubao capsule high-dose group and Xianling gubao capsule group （P<0.05）； fracture stress of fracture side were increased significantly in new Xianling gubao capsule medium-dose and high-dose groups and Xianling gubao capsule group （P<0.05 or P<0.01）. The serum levels of TNF-α and IL-1β were decreased significantly （P<0.01）. There was no statistical significance in above indexes among new Xianling gubao capsule groups and Xianling gubao capsule group （P>0.05）. The area of the callus in each group was smaller； the fracture line became blurred； the fracture trace disappeared and the number of bone trabeculae increased. The cortical layer was thickened， and a large number of capillary implants were found in the bone marrow cavity. CONCLUSIONS： New Xianling gubao capsule has a significant role in promoting fracture healing， and can effectively improve the strength of bone biomechanics and inhibit the inflammatory reaction.

KEYWORDS New Xianling gubao capsule； Rats； Fracture； Bone biomechanics； Inflammatory factors

仙靈骨葆膠囊為治療骨質(zhì)疏松癥類非處方藥品，2009年開始被收錄在《國家基本藥物目錄》中，是防治骨質(zhì)疏松癥的首選藥物。經(jīng)多年的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，其對骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨關(guān)節(jié)炎和骨無菌性壞死等的療效穩(wěn)定可信[1-3]。但因仙靈骨葆膠囊原方由多味中藥組成，服用劑量較大，為進一步提高其市場競爭力和改善患者依從性，本課題組通過將仙靈骨葆膠囊溶解后過大孔吸附樹脂HP-20色譜柱、乙醇洗脫，得到仙靈骨葆膠囊提取物，然后采用骨質(zhì)疏松、骨折、骨關(guān)節(jié)炎等動物模型，結(jié)合活性成分的多指標(biāo)模式的質(zhì)量控制方法，確認預(yù)防骨質(zhì)疏松、骨折、骨關(guān)節(jié)炎等的最佳劑量、關(guān)鍵餾分后進行重新組方，得到新仙靈骨葆膠囊。本研究將利用骨折大鼠模型，觀察新仙靈骨葆膠囊促進大鼠骨折愈合的作用，為尋求“減量增效（減量等效）” 仙靈骨葆膠囊新組方的開發(fā)利用提供藥理實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ALC-210.3電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；TGL-12GB-C臺式高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ZS-3酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機電廠）；YLS-16A小動物骨骼強度測定儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；BX-51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

新仙靈骨葆膠囊（批號：20130906，規(guī)格：0.3 g/粒，用法用量：口服，每日1次，每次3粒）和仙靈骨葆膠囊（批號：20130815，規(guī)格：0.5 g/粒，用法用量：口服，每日2次，每次3粒）均購自國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（北京欣博盛生物科技有限公司，批號：20161105、20161107）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量220～250 g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（渝）2014-0003。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、仙靈骨葆膠囊組（350 mg/kg，根據(jù)成人臨床用量換算而得）和新仙靈骨葆膠囊低、中、高劑量組（53、105、210 mg/kg，其中中劑量為成人臨床用量的等效劑量），每組14只，♀♂各半。參照文獻方法造模[4-6]：大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒右下肢股骨段，取股外側(cè)切口，經(jīng)股前、外側(cè)肌間隔分離暴露股骨，在股骨中段（大轉(zhuǎn)子下1 cm）用低速牙科鉆切斷股骨，逐層關(guān)閉傷口，常規(guī)消毒。假手術(shù)組大鼠只暴露股骨，不切斷股骨。術(shù)后，待大鼠完全清醒后即開始灌胃給藥，給藥體積為10 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥4周，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水。

2.2 血清中炎癥因子水平測定

末次給藥后1 h，稱大鼠體質(zhì)量，麻醉，腹主動脈取血，以離心半徑10 cm、3 000 r/min離心10 min，分離血清。采用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1β水平，實驗操作嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.3 骨折處骨痂形成及組織病理學(xué)變化觀察

處死大鼠，每組隨機選取6只大鼠，迅速取材右側(cè)股骨，光鏡下觀察大鼠股骨骨折愈合情況（骨折處骨痂形成情況），并采用顯微鏡的測微尺測量骨折處結(jié)痂面積大小。隨后將取出的股骨放入10%甲醛中固定，進行切片制作，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察骨折處組織病理變化。

2.4 骨折側(cè)骨生物力學(xué)指標(biāo)測定

分別將各組剩余的8只大鼠處死，取右側(cè)股骨，剔除股骨上附著的肌肉和韌帶后，用YLS-16A小動物骨骼強度測定儀對股骨進行最大荷載測試（骨折應(yīng)力）和骨結(jié)構(gòu)強度測試（骨壓碎力）的骨生物力學(xué)測量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用x±s表示，應(yīng)用單因素方差分析進行顯著性檢驗，方差齊時采用LSD法進行組間兩兩比較，方差不齊時采用Dunnetts法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量測定結(jié)果

造模后大鼠生長較緩慢，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，新仙靈骨葆膠囊高劑量組和仙靈骨葆膠囊組大鼠在藥后4周后體質(zhì)量顯著升高（P<0.05）。與仙靈骨葆膠囊比較，新仙靈骨葆膠囊各劑量組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表1。

3.2 骨折愈合情況及病理學(xué)觀察結(jié)果

3.2.1 骨折愈合情況 大體觀察結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠骨皮質(zhì)完整；各造模組大鼠均可見骨折線，骨折周圍有明顯骨痂形成；各給藥組大鼠骨痂面積較模型組變小，骨折線變模糊，骨折痕跡基本消失，見圖1。

經(jīng)顯微鏡測微尺測量，模型組骨痂面積大約為0.2 cm2，新仙靈骨葆低劑量組骨痂面積大約為0.2 cm2，新仙靈骨葆中劑量組骨痂面積大約為0.16 cm2，新仙靈骨葆高劑量組骨痂面積大約為0.12 cm2，仙靈骨葆膠囊組骨痂面積大約為0.12 cm2。

3.2.2 病理學(xué)觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠骨折端仍有透明軟骨存在，局部有纖維性骨痂；骨小梁不成熟，排列紊亂、疏松，骨折線仍可見。新仙靈骨葆膠囊低劑量組大鼠大部分為骨性骨痂，少許軟骨性骨痂，骨小梁排列稍紊亂、疏松。新仙靈骨葆中劑量組大鼠大部分為骨性骨痂，少許軟骨性骨痂；骨小梁增多，已漸趨成熟，排列已稍有序，與主應(yīng)力方向一致。新仙靈骨葆膠囊高劑量組大鼠基本為骨性骨痂，可見大量骨小梁，且已漸趨成熟，粗細均勻，排列較為一致，與主應(yīng)力方向一致；骨髓腔可見毛細血管植入，骨折線已模糊。仙靈骨葆膠囊組大鼠均為骨性骨痂；骨小梁已較成熟，粗細均勻，排列較為一致，與主應(yīng)力方向一致；板層骨形成周圍結(jié)締組織和骨髓腔可見較多毛細血管植入且髓腔已通，骨折線較模糊。各組大鼠骨折處組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖2。

3.3 血清中炎癥因子水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，新仙靈骨葆膠囊各劑量組和仙靈骨葆膠囊組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.01）。與仙靈骨葆膠囊比較，新仙靈骨葆膠囊各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平測定結(jié)果見表2。

3.4 骨折側(cè)骨生物力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的骨折應(yīng)力、骨壓碎力均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，新仙靈骨葆膠囊中、高劑量組和仙靈骨葆膠囊組大鼠的高骨折應(yīng)力均顯著升高（P<0.05或P<0.01），各給藥組大鼠的骨壓碎力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與仙靈骨葆膠囊比較，新仙靈骨葆膠囊各劑量組大鼠的骨折應(yīng)力和骨壓碎力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠骨折側(cè)骨折應(yīng)力和骨壓碎力測定結(jié)果見表3。

4 討論

仙靈骨葆膠囊由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、地黃等藥材組成，具有滋補肝腎、活血通絡(luò)、強筋健骨的功能，是防治骨質(zhì)疏松癥的首選藥物。該藥在臨床治療骨折方面也取得突破性進展，其促進骨折愈合的作用也逐漸得到認可[7-9]。相關(guān)研究認為，仙靈骨葆膠囊治療骨折的機制可能是通過性激素樣作用、增強成骨細胞活性、平衡肌體內(nèi)環(huán)境和微量元素、促進礦物質(zhì)在骨中的沉積，從而促進骨痂的生長。田發(fā)明等[10]證實，仙靈骨葆膠囊可提高骨折大鼠骨痂組織的血管數(shù)量，提示其可促進骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合早期血管的形成。任光友等[11]研究發(fā)現(xiàn)，仙靈骨葆膠囊可增加骨折大鼠血清生長激素，提示其參與了促進骨折愈合。穆樹林等[12]研究發(fā)現(xiàn)，仙靈骨葆膠囊可加快骨折大鼠編織骨向板層骨的轉(zhuǎn)化，促進骨折愈合。

骨折是骨的完整性和連續(xù)性中斷。依據(jù)組織、細胞學(xué)的變化，將骨折愈合分為炎癥反應(yīng)血腫機化期、原始骨痂形成期和骨痂改建塑形期幾個階段。本研究制作大鼠股骨中段骨折模型，大鼠骨折術(shù)后4周大致模擬了血腫機化末期與原始骨痂形成初期階段，新生血管的形成是這一階段的重要特征，局部血液供應(yīng)將促進骨折愈合，但該階段持續(xù)高表達的炎癥反應(yīng)對骨折修復(fù)過程是一個不利因素[13-14]。實驗中觀察到新仙靈骨葆膠囊可增加骨折處組織骨小梁，形成骨性骨痂，骨髓腔植入大量毛細血管，這提示新仙靈骨葆膠囊可促進骨折大鼠骨折處新生血管形成，促進骨折處局部血液供應(yīng)，可加快骨折愈合；且新仙靈骨葆膠囊可顯著降低血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平，抑制炎癥反應(yīng)，有利于骨折修復(fù)。本研究結(jié)果還表明，新仙靈骨葆膠囊可顯著增加骨折大鼠體質(zhì)量，明顯提高骨折側(cè)骨折應(yīng)力，增強骨生物力學(xué)強度；且病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，新仙靈骨葆膠囊組大鼠的骨痂面積較模型組變小，骨折線變模糊，骨折痕跡基本消失，具有明顯的促進骨折愈合作用。并且，新仙靈骨葆膠囊的上述作用與仙靈骨葆膠囊無顯著差異，作用相當(dāng)。

綜上所述，本研究從組織學(xué)、生物力學(xué)、生物化學(xué)等方面對新仙靈骨葆膠囊促進骨折愈合作用進行了研究。研究結(jié)果證實新仙靈骨葆膠囊對大鼠骨折愈合有促進作用，且該作用與仙靈骨葆膠囊作用相當(dāng)，表明新仙靈骨葆膠囊在促進骨折愈合方面達到了“減量等效”的目的，但其促進骨折愈合的作用機制仍不是十分明確，需要進一步從細胞、分子水平去探討。

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（收稿日期：2017-11-11 修回日期：2018-02-05）

（編輯：林 靜）