涂碎萍 侯雅琴 邊原 封永莉 李晉奇 張麗娟 陳璐

中圖分類號 R961.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1205-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.13

摘 要 目的：比較6種甘草酸鹽乳膏劑中甘草酸的體外經(jīng)皮滲透特性，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。方法：以改良的Franz擴(kuò)散池和離體大鼠皮進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透試驗，采用高效液相色譜（HPLC）法測定6種甘草酸鹽（甘草酸單銨、甘草酸二銨、甘草酸單鉀、甘草酸二鉀、甘草酸三鈉、甘草酸二鈉）乳膏劑中甘草酸24 h累積滲透量，并計算其透皮吸收速率以評價6種甘草酸鹽乳膏劑的透皮特性。結(jié)果：6種甘草酸鹽在大鼠皮膚的24 h累積滲透量大小順序為甘草酸三鈉（23.933 μg/cm2）>甘草酸二鉀（22.952 μg/cm2）>甘草酸二鈉（15.424 μg/cm2）>甘草酸單鉀（10.703 μg/cm2）>甘草酸二銨（9.557 μg/cm2）>甘草酸單銨（1.621 μg/cm2）；經(jīng)皮滲透速率快慢的順序為甘草酸三鈉[1.010 2 μg/（cm2·h）]>甘草酸二鉀[0.974 5 μg/（cm2·h）]>甘草酸二鈉[0.641 2 μg/（cm2·h）]>甘草酸二銨[0.399 9 μg/（cm2·h）]>甘草酸單鉀[0.362 8 μg/（cm2·h）]>甘草酸單銨[0.072 6 μg/（cm2·h）]。結(jié)論：6種不同甘草酸鹽乳膏劑中，甘草酸三鈉體外經(jīng)皮滲透速率最高。

關(guān)鍵詞 甘草酸鹽；乳膏劑；高效液相色譜法；透皮吸收

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare in vitro percutaneous permeation characteristics of glycyrrhizic acid in 6 kinds of glycyrrhetate creams， and to provide reference for further development and utilization. METHODS： Modified Franz diffusion cell and isolated rat skin were adopted for in vitro percutaneous permeation test. 24 h accumulative permeation of glycyrrhizic acid in 6 kinds of glycyrrhetate creams （monoammonium glycyrrhizinate， diammonium glycyrrhizinate， monopotassium glycyrrhizinate， dipotassium glycyrrhizate， trisodium glycyrrhizinate， disodium glycyrrhetate） were determined by HPLC. The permeation characteristics of 6 kinds of glycyrrhetate creams were evaluated by calculating percutaneous absorption rate. RESULTS： 24 h accumulative permeation of 6 kinds of glycyrrhetate in rat skin in descending order was as follows： trisodium glycyrrhizinate （23.933 μg/cm2）>dipotassium glycyrrhizinate （22.952 μg/cm2）>disodium glycyrrhizinate （15.424 μg/cm2）>monopotassium glycyrrhizinate （10.703 μg/cm2）>diammonium glycyrrhizinate （9.557 μg/cm2）>monoammonium glycyrrhizinate （1.621 μg/cm2）. The percutaneous permeation rate in descending order was as follows as trisodium glycyrrhizinate [1.010 2 μg/（cm2·h）]>dipotassium glycyrrhizinate [0.974 5 μg/（cm2·h）]>disodium glycyrrhizinate [0.641 2 μg/（cm2·h）]>diammonium glycyrrhizinate [0.399 9 μg/（cm2·h）]>monopotassium glycyrrhizinate [0.362 8 μg/（cm2·h）]>monoammonium glycyrrhizinate [0.072 6 μg/（cm2·h）]. CONCLUSIONS： The permeation rate of trisodium glycyrrhizinate is the highest among 6 kinds of glycyrrhetate creams in vitro.

KEYWORDS Glycyrrhetate； Cream； HPLC； Percutaneous absorption

皮炎濕疹是臨床常見的皮膚病，病程長、易反復(fù)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。甘草酸是傳統(tǒng)中藥甘草的有效提取成分，具有皮質(zhì)激素樣作用，有保肝解毒、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用[2-5]。甘草酸單銨、甘草酸二銨、甘草酸單鉀、甘草酸二鉀、甘草酸三鈉、甘草酸二鈉是甘草酸常見的6種鹽，在臨床上甘草酸鹽是治療濕疹的常見藥物，多以靜脈注射給藥為主。但其口服或注射易出現(xiàn)蓄積，引起如水腫、低血鉀、高血壓及心臟異常等癥狀[4-5]。將甘草酸鹽制成經(jīng)皮給藥的乳膏劑具有靶向、無創(chuàng)、緩釋及無肝首關(guān)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，可提高患者的依從性[6]。本試驗通過比較6種不同甘草酸鹽乳膏劑中甘草酸體外經(jīng)皮滲透結(jié)果以篩選出透皮性好的甘草酸鹽，為進(jìn)一步研制甘草酸鹽外用制劑提供試驗參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）、BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；優(yōu)普UPR- II-5T超純水器（成都超純科技有限公司）；Biosharp 0.45 μm微孔濾膜（Biosharp生物科技有限公司）；RYJ-6B 藥物透皮擴(kuò)散試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；HC-2518高速離心機(jī)（安徽中科中佳科技有限公司）；W201D恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

甘草酸單銨對照品（成都普思生物科技有限公司，批號：PS0061-0020，純度：98.5%）；甘草酸單銨、甘草酸二銨、甘草酸單鉀、甘草酸二鉀、甘草酸三鈉、甘草酸二鈉原料藥均購自湖北恒綠源科技有限公司（批號：HLY20160305-33、HLY20160305-31、HLY20160305-12、HLY20160305-13、HLY20160524-05、HLY20160306-35，純度：均大于98%）；甘油、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、十六醇、十二烷基硫酸鈉、羥苯乙酯原料藥均購自湖南爾康制藥股份有限公司（批號：000120161004、101820161001、105620160103、105120160502、102420160105、10362016- 0101，純度：均大于99%）；白凡士林原料藥（南昌白云藥業(yè)有限公司，批號：20160101，純度：99%）；甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸、乙醇為分析純，水為純化水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠20只，♂，體質(zhì)量180～200 g，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗動物研究所提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（川）2015-030。

2 方法與結(jié)果

2.1 乳膏劑的制備

2.1.1 空白乳膏劑 取70 g單硬脂酸甘油酯、140 g硬脂酸、85 g白凡士林、20 g十六醇、1 g羥苯乙酯混合，于水浴上加熱至70 ℃左右，制得油相；10 g十二烷基硫酸鈉、85 g甘油溶于適量純化水中，并加熱至70 ℃左右，得水相；將油相緩緩加入水相中，不斷攪拌，凝固，即得空白乳膏劑。

2.1.2 6種甘草酸鹽乳膏劑 取6種甘草酸鹽原料藥各5 g，分別置于研缽中，以等量遞加原則加入“2.1.1”項下制備的空白乳膏劑適量，順時針研磨，即得甘草酸鹽乳膏劑，經(jīng)含量測定其中甘草酸含量為10%，置于冰箱（4 ℃）中保存。使用前用玻璃棒混勻，避免藥物沉降。

2.2 甘草酸鹽含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-含0.05%磷酸鹽緩沖液（35 ∶ 65，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：252 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 甘草酸單銨標(biāo)曲貯備液的制備 精密稱取甘草酸單銨對照品10 mg，用90%甲醇溶液溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的甘草酸單銨標(biāo)曲貯備液（甘草酸質(zhì)量=甘草酸單銨質(zhì)量/1.02）。取質(zhì)量濃度為1 mg/mL甘草酸單銨標(biāo)曲貯備液適量，以含20%乙醇的生理鹽水溶液稀釋，搖勻，即得質(zhì)量濃度為60 μg/mL的甘草酸單銨標(biāo)曲貯備液，置于冰箱（4 ℃）中保存。

2.2.3 甘草酸單銨質(zhì)控貯備液的制備 精密稱取甘草酸單銨對照品10 mg，用90%甲醇溶液溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的甘草酸單銨質(zhì)控貯備液。取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的甘草酸單銨質(zhì)控貯備液適量，以含20%乙醇的生理鹽水溶液稀釋，搖勻，即得高、中、低質(zhì)量濃度（45.00、7.50、0.47 μg/mL）的甘草酸單銨質(zhì)控貯備液，置于冰箱（4 ℃）中保存。

2.2.4 樣品處理 取6種甘草酸鹽乳膏劑的透體吸收液各200 μL，分別加入400 μL二氯甲烷，渦旋3 min，14 000 r/min離心5 min（離心半徑6 cm），取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取質(zhì)量濃度為60 μg/mL的甘草酸單銨標(biāo)曲貯備液適量，加入含20%乙醇的生理鹽水溶液稀釋，搖勻，分別制得質(zhì)量濃度為60.00、30.00、15.00、7.50、3.75、1.87、0.94、0.47、0.23、0.12 μg/mL工作液，按“2.2.4”項下方法處理，進(jìn)樣測定。以各質(zhì)量濃度溶液對照品峰面積積分值（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 y=1.80×104x+1.39×102（R2=0.999 2）。結(jié)果表明，甘草酸單銨質(zhì)量濃度在0.12～60.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 系統(tǒng)適用性試驗 分別取質(zhì)量濃度為7.50 μg/mL的甘草酸單銨標(biāo)曲貯備液、“2.1.1”項下空白乳膏劑、“2.1.2”項中的甘草酸二鈉乳膏劑，按“2.2.4”項下方法處理后，按“2.3.2”項下方法處理24 h后，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果表明，乳膏基質(zhì)中的物質(zhì)對測定無干擾，色譜峰形對稱，峰寬小于0.5 min，與雜質(zhì)分離度良好。色譜圖見圖1。

2.2.7 方法學(xué)考察 制備低、中、高質(zhì)量濃度（45.00、7.50、0.47 μg/mL）質(zhì)控樣品進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果，日內(nèi)精密度試驗的RSD≤1.79%（n=6），日間精密度的RSD≤1.93%（n=3）；常溫下5 d內(nèi)穩(wěn)定性試驗的RSD≤1.53%（n=3）；平均加樣回收率為96.5%，RSD≤0.72%（n=9），均符合相關(guān)要求。

2.3 體外透皮試驗

2.3.1 離體皮膚制備 取20只SD大鼠，迅速摘眼球處死，將腹部毛剃盡，剪下腹部皮膚，小心去除皮下組織和脂肪，用生理鹽水清洗干凈，保存于生理鹽水中冷藏，24 h內(nèi)使用，使用前檢查皮膚的完整性[7-8]。

2.3.2 累積滲透量（Q）和透皮速率計算結(jié)果 取“2.3.1”項下SD大鼠皮膚，用生理鹽水沖洗，自然固定在Franz擴(kuò)散池上，有效擴(kuò)散面積為3.14 cm2，使皮膚表面面向供藥室，皮膚里層與接受液剛好接觸。接受液為脫氣并預(yù)熱（32 ℃）的含20%乙醇的生理鹽水溶液[8-11]，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，接受室水浴溫度為32 ℃。供藥室中先加入適量生理鹽水，透皮30 min排除皮膚內(nèi)空氣及雜質(zhì)后，重新?lián)Q入脫氣并預(yù)熱（32 ℃）的含20%乙醇的生理鹽水溶液。精密稱取含藥乳膏0.5 g，均勻涂抹于供藥室大鼠皮膚上，6種甘草酸鹽乳膏與皮膚完全接觸。分別于0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h時取樣0.5 mL，并及時補(bǔ)充0.5 mL接受液。接受液用0.45 μm水系微孔濾膜濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，作為測定用的供試品溶液。按照下列公式計算各時間點(diǎn)6種甘草酸鹽乳膏劑的Q[12-13]：

式中，A為接收池面積，V0為接收液總體積，V為取樣體積，n為取樣次數(shù)，i為取樣時間。ci為i時間取樣時接受液的藥物質(zhì)量濃度，cn為n次取樣時接收液中藥物質(zhì)量濃度。對藥物滲透曲線（Q-t）作切線，切線的斜率即為經(jīng)皮滲透速率（J）。24 h內(nèi)不同時間累積滲透量見表1；累積滲透量與時間關(guān)系的方程式見表2；累積滲透量與時間的關(guān)系見圖2。

表1、表2結(jié)果顯示，在相同乳化體系中，6種甘草酸鹽的Q大小為甘草酸三鈉>甘草酸二鉀>甘草酸二鈉>甘草酸單鉀>甘草酸二銨>甘草酸單銨；J快慢為甘草酸三鈉>甘草酸二鉀>甘草酸二鈉>甘草酸二銨> 甘草酸單鉀>甘草酸單銨。通過HPLC法測定6種甘草酸鹽乳膏劑中甘草酸體外透皮量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上6種不同甘草酸鹽乳膏劑中甘草酸三鈉和甘草酸二鉀的體外經(jīng)皮透過率相對較高。

3 討論

本試驗采用等量遞加法將甘草酸鹽原料藥加入空白基質(zhì)，以適量甘油和水改善黏度，研磨后制備成含藥量達(dá)10%的甘草酸鹽乳膏劑，研究其體外經(jīng)皮滲透性。試驗結(jié)果表明，在相同制備方法下，相同質(zhì)量濃度的6種甘草酸鹽乳膏劑其藥物累積滲透量及經(jīng)皮滲透率差異較大。原因可能與6種甘草酸鹽乳膏劑的黏度及大鼠皮膚上分布的離子通道相關(guān)[14-15]。

藥物透過角質(zhì)層速度是藥物經(jīng)皮吸收的主要限速步驟。而多數(shù)研究顯示，藥物透過角質(zhì)層主要通過細(xì)胞間質(zhì)途徑，忽略了上皮細(xì)胞膜的離子載體和通道蛋白對藥物透過性的影響。通道蛋白是橫跨細(xì)胞膜的親水性通道，允許適當(dāng)大小的離子順濃度梯度通過。離子通道的特殊結(jié)構(gòu)，只允許特定離子通過[16-17]。本試驗結(jié)果中，Q大小為甘草酸三鈉>甘草酸二鉀>甘草酸二鈉>甘草酸單鉀；J快慢為甘草酸三鈉>甘草酸二鉀>甘草酸二鈉>甘草酸單鉀。顯示不同甘草酸鹽所含金屬離子的單位摩爾數(shù)越多，其乳膏劑的累積滲透量與透皮吸收速率越高。結(jié)果提示其透皮吸收特性可能與上皮細(xì)胞膜上該金屬離子的離子載體和通道蛋白的數(shù)量與細(xì)胞膜兩側(cè)濃度差相關(guān)。

藥物在基質(zhì)中的狀態(tài)影響其吸收量，6種甘草酸鹽乳膏劑中甘草酸單銨的乳膏劑黏度最大。通過調(diào)整水與甘油的比例、加入氮酮等仍無法改善其乳膏劑黏度。其原因與物理性質(zhì)相關(guān)。甘草酸單銨難溶于水，在水包油型的乳膏基質(zhì)中與基質(zhì)親和性差，不易分散且不易涂抹。為改善其缺陷，目前常用凝膠劑[17]或是乙醇脂質(zhì)體作為甘草酸單銨載體，以改善甘草酸單銨的難溶于水的特點(diǎn)，從而提高其經(jīng)皮滲透速率。

預(yù)試驗結(jié)果表明，含10%、15%乙醇的生理鹽水溶液對相關(guān)藥物透皮參數(shù)無影響，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，對相關(guān)參數(shù)的影響增大，含50%乙醇的生理鹽水溶液可顯著提高透皮速率。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過20%時，正常皮膚表面的褶皺逐漸消失，并伴有脫落的鱗片狀物、毛囊口擴(kuò)展。因此，在大鼠皮膚的體外透皮試驗中，接受液中乙醇體積分?jǐn)?shù)超過20%時，將影響皮膚正常生理結(jié)構(gòu)從而改變其屏障特性，因此接受液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在20%以下[18]。

本試驗結(jié)果表明，6種不同的甘草酸鹽乳膏劑具有不同的體外透皮特性，其中甘草酸三鈉和甘草酸二鉀的體外經(jīng)皮滲透速率相對較高，可為進(jìn)一步研制甘草酸鹽外用制劑提供數(shù)據(jù)參考。

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（收稿日期：2017-08-29 修回日期：2018-01-26）

（編輯：劉明偉）