童愛均 趙超 曾峰

摘 要：β葡萄糖苷酶是纖維素分解酶系中的重要組成部分，具有廣泛的應(yīng)用前景。以牛瘤胃為材料，篩選得到4株β葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株，采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定各菌株的β葡萄糖苷酶酶活力，選取1株β葡萄糖苷酶酶活力較高的菌株，結(jié)合16S rDNA序列分析方法對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明：篩選到1株產(chǎn)β葡萄糖苷酶活力為6.589U·mL-1的菌株命名為TA1；經(jīng)鑒定該菌株為液化沙雷菌屬（Serratia liquefaciens）。研究結(jié)果對(duì)產(chǎn)β葡萄糖苷酶的微生物資源獲取具有一定的借鑒意義。

關(guān)鍵詞：β葡萄糖苷酶；16S rDNA序列；分子生物學(xué)鑒定

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.07.002

Abstract： βglucosidase is an important component of the cellulolytic enzyme system and has broad application prospects. Four βglucosidaseproducing strains were screened from bovine rumen， and the enzymatic activity of βglucosidase was determined by 3，5dinitrosalicylic acid （DNS） method， seletcted a strain which had high βglucosidase activity，and the molecular biology of strain was identified by 16SrDNA sequence analysis. The results showed that an obtained strain with enzyme activity of6.589U·mL-1was named TA1. This strain which was identified to be Serratia liquefaciens. The research results have certain reference significance for the acquisition of microbial resources for producing βglucosidase.

Key words： βglucosidase； 16S rDNA sequence； identification by molecular biology

β葡萄糖苷酶是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷酶鍵生成葡萄糖的纖維素水解酶類[1]。β葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物等各種生物體內(nèi)[2-5]。β葡萄糖苷酶是降解纖維素的主要組分之一，在纖維素降解中起著非常重要的作用[6-9]。因此，篩選高產(chǎn)β葡萄糖苷酶的微生物對(duì)纖維素有效降解具有重要意義。β葡萄糖苷酶被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、加工工業(yè)和醫(yī)療等領(lǐng)域[10-12]。在食品工業(yè)中，β葡萄糖苷酶主要用于改良果汁風(fēng)味[13]。但目前β葡萄糖苷酶活力偏低，本研究以獲取高產(chǎn)β葡萄糖苷酶的菌株為目的，從牛瘤胃中篩選得到1株β葡萄糖苷酶的產(chǎn)生菌株，為產(chǎn)β葡萄糖苷酶的微生物資源獲取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌體和菌種 菌體：牛瘤胃的提取液；工程菌：本實(shí)驗(yàn)室保存的E.coli DH5α。

1.1.2 主要試劑 K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgCl2·6H2O、NH4Cl、NaCl、FeSO4、瓊脂、葡萄糖為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)品和PCR有關(guān)試劑為上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)（SWOJFD），蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG9240A），上海恒一科學(xué)儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP9160M），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；全溫振蕩器（ZHWY211B），上海智城分析儀器設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋（G180TW），美國(guó)致微（廈門）儀器有限公司；超純水系統(tǒng)（明澈TMD），Merck millipore有限公司；低速離心機(jī)（SC3612），上海雙旭電子有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Avanti），Beckman 公司；PCR儀（PC814A），日本ASTEC公司；電泳儀（PROTBANIIXI2D），BIORAD 公司；凝膠成像系統(tǒng)（FIREREADER V4），UVITEC公司；電子天平（ME204E），梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.96 g·L-1，KH2PO4 0.75 g·L-1，MgCl2·6H2O 0.4g·L-1，NH4Cl 0.9 g·L-1，NaCl 0.9 g·L-1，1%FeSO4 0.3 mL ，羧甲基纖維素鈉（簡(jiǎn)稱CMC）1%，pH值為6.0，1.6%瓊脂，高壓滅菌（121℃，20 min），倒平板備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.96 g·L-1， KH2PO4 0.75 g·L-1， MgCl2·6H2O 0.4 g·L-1， NH4Cl 0.9 g·L-1， NaCl 0.9 g·L-1，1%FeSO4 0.3 mL， CMC 1%，pH值為6.0，高壓滅菌（121℃，20 min），備用。

1.3 試驗(yàn)方法

童愛均等：產(chǎn)β葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定2018年第7期

2018年第7期童愛均等：產(chǎn)β葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

1.3.1 菌株的初篩 取牛瘤胃1 mL于50 mL液體培養(yǎng)基放在37℃空氣恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d后，培養(yǎng)后的菌液稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6懸濁液，取稀釋后的菌液1 mL于初篩培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為37℃，時(shí)間為3 d。將培養(yǎng)后的平板挑取單菌落再次劃線純化，直到獲得純菌落為止。將分離得到的純菌株點(diǎn)到初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后用1

mg·mL-1的甘果紅溶液染色20 min，倒掉染色液后用1mol·L-1NaCl 溶液脫色30 min。以透明圈直徑和菌落直徑的比值大小作為篩選菌株的標(biāo)準(zhǔn)，再將篩選到的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2 菌株的復(fù)篩 將初篩得到的菌株按5%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃、120r·min-1，振蕩培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液，于4℃、8000r·min-1離心20 min去菌體，取其上清液用DNS法測(cè)定β葡萄糖苷酶活力，挑選酶活力最高且穩(wěn)定的菌株。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg分析純葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后，定容至100 mL，濃度為1mg·mL-1。各試劑用量列于表1。

將各管溶液混勻后，在沸水浴中加熱10 min，然后取出，立即用流動(dòng)水冷卻至室溫，分別用蒸餾水定容至10 mL并搖勻。于540 nm處測(cè)吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 DNS法測(cè)定酶活力 吸取粗酶液0.5 mL，加入經(jīng)30℃保溫10 min、含1%CMC、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液1.5 mL，30℃保溫30 min。然后加入3 mLDNS液，放入沸水浴中煮沸10 min后，迅速用流動(dòng)水冷卻至室溫，再用蒸餾水定容至10 mL（DNS為鈍化酶活做空白對(duì)照）。1 h內(nèi)用可見分光光度計(jì)在540 nm處比色測(cè)定。測(cè)量得到的數(shù)據(jù)代入由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量值計(jì)算出來的回歸方程，在由回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的被測(cè)酶液所含葡萄糖量，根據(jù)酶活力計(jì)算公式算出酶活力大小。酶活力定義為上述條件下，1 mL發(fā)酵液1 min催化底物生成1 umol還原糖（以葡萄糖量計(jì)）為1個(gè)酶活力單位U，酶活力計(jì)算公式：U=（B×n/T×V）×v×1000/180

式中U：葡萄糖酶活力（U·mL-1），B：從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的凈葡萄糖含量，n：酶液稀釋倍數(shù)，v：酶和底物反應(yīng)體積（mL），1000mg·ug-1，T：酶和底物反應(yīng)時(shí)間（min），V：測(cè)定時(shí)稀釋酶液體積（mL），180：葡萄糖分子量。

1.3.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.3.5.1 總DNA提取 隨機(jī)選取篩選出的單菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，然后用CTAB/NaCl少量提取法提取。

1.3.5.2 目的基因片段PCR擴(kuò)增 利用通用擴(kuò)增16SrRNA基因的引物27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和1492R：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)計(jì)PCR的體系為25 μL，其中ddH2O 15.5 μL，5×PCR緩沖液 5.0 μL，dNTP2.0 μL，引物0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Taq酶 0.5 μL。其中PCR擴(kuò)增參數(shù)為：首先95℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10 min，12℃終止反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.5.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，連接PMD18T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTop10，菌落PCR檢測(cè)陽性克隆子。

1.3.5.4 陽性克隆的驗(yàn)證 質(zhì)粒的提?。簭?6SrDNA文庫中隨機(jī)挑取30個(gè)克隆子分別接種于含有20mg·mL-1Amp+的5 mL LB培養(yǎng)液中，與200 r·min-1搖床37℃下培養(yǎng)12 h，采用上海生工Sanprep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，提取步驟參見試劑盒說明書。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒提取結(jié)果。

重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證：按質(zhì)粒DNA 8 uL，EcoRⅠ 1 uL，Hind Ⅲ1 uL ，Buffer（10×）2 uL，ddH2O 8 uL體系于37℃水浴反應(yīng)3～5 h。水浴后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切驗(yàn)證的結(jié)果。酶切成功后送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種平板的初篩

將分離得到的純菌株點(diǎn)到初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后用1 mg·mL-1的甘果紅溶液染色20 min，倒掉染色液后用1 mol·L-1 NaCl 溶液脫色30 min。以透明圈直徑和菌落直徑的比值大小作為篩菌的標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，有4株菌株能夠產(chǎn)生水解圈。將得到的4株菌株能夠產(chǎn)生水解圈單菌落進(jìn)行復(fù)篩。圖1為某個(gè)菌株初篩在平板上得到的水解透明圈。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖2）可見，葡萄糖含量與其吸光值呈良好的線性函數(shù)關(guān)系，其函數(shù)關(guān)系式為y=0.4982x-0.0171，式中的y表示OD值，x表示葡萄糖含量，R2=0.997，表明線性關(guān)系良好，可以用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 酶活力復(fù)篩 將初篩得到的菌株用DNS法測(cè)β葡萄糖苷酶活力，挑選酶活力最高且穩(wěn)定的菌株。用DNS法測(cè)定β葡萄糖苷酶活力得到的結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，1號(hào)菌株的酶活力最高，為6.589 U·mL-1。通過復(fù)篩獲得的1號(hào)菌株其產(chǎn)β葡萄糖苷酶酶活力較高，并對(duì)其進(jìn)行反復(fù)培養(yǎng)，證明其產(chǎn)酶特性較為穩(wěn)定。因此，將該菌株命名為TA1，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 16SrDNA PCR擴(kuò)增及克隆結(jié)果 利用通用擴(kuò)增16SrRNA基因的引物27F對(duì)菌株TA1進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，TA1 16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，連接PMD18T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTop10，菌落PCR檢測(cè)陽性克隆子。從16SrDNA文庫中隨機(jī)挑取30個(gè)克隆子，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒提取結(jié)果。再通過重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證表明獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物酶切成功。

2.3.2 菌株16SrDNA序列測(cè)定 將酶切成功后的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。菌株TA1的16SrDNA序列長(zhǎng)度為1597 bp，將測(cè)序得到的序列后期用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。其具體序列信息為見圖5。

2.3.3 同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹 將測(cè)序得到的序列用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，下載與目標(biāo)菌株序列同源性較高的菌株14株，運(yùn)用MEGA5.0軟件以NJ計(jì)算方法生成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖6所示。其同源性高達(dá)99%，表明鑒定的菌株為液化沙雷菌屬（Serratia liquefaciens） 。

3 結(jié)論

通過剛果紅染色鑒定產(chǎn)β葡萄糖苷酶菌是一種快速簡(jiǎn)便的篩選方法，透明圈直徑和菌落直徑大小的比值能夠直接反應(yīng)菌落產(chǎn)β葡萄糖苷酶的能力。本研究以牛瘤胃為材料，通過初篩得到4株β葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株，采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定β葡萄糖苷酶酶活力，得到1株酶活力為6.589 U·mL-1的菌株命名為TA1。經(jīng)16SrDNA分子生物學(xué)鑒定，該菌株為液化沙雷菌屬（Serratia liquefaciens）。研究結(jié)果對(duì)產(chǎn)β葡萄糖苷酶的微生物資源獲取具有一定的借鑒意義。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）