李軍山 聶麗建 冀艷花 李雪利 常云鳳 李振江

摘 要：為了提高白鮮皮配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用15批白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了質(zhì)量評價(jià)體系。

第1次加入10倍的水、浸泡30 min、煎煮20 min，第2次加入8倍的水、煎煮15 min，以標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用HPLC法測定黃柏酮和梣酮的含量及指紋圖譜。結(jié)果顯示：15批白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑中黃柏酮的轉(zhuǎn)移率為25.08%～44.08%，平均轉(zhuǎn)移率為34.79%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.37%；梣酮轉(zhuǎn)移率為22.63%～32.86%，平均轉(zhuǎn)移率為27.94%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56%；出膏率為20.56%～34.42%，平均出膏率為29.05%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.33%。采用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行指紋圖譜測定，得到共有峰10 個(gè)，指認(rèn)出白鮮堿、黃柏酮、梣酮3個(gè)峰。由此可知，白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝規(guī)范，樣品質(zhì)量穩(wěn)定，指紋圖譜相似度大于0.92，可用于白鮮皮配方顆粒的質(zhì)量控制，并為白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的應(yīng)用和其他根莖類飲片的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥藥劑學(xué)；白鮮皮飲片；標(biāo)準(zhǔn)湯劑；黃柏酮；梣酮；出膏率；指紋圖譜

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1534（2018）05-0370-07

白鮮皮，出自《藥性論》，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[1]，為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz.） 的干燥根皮[2]，主產(chǎn)于遼寧、河北、山東，江蘇、山西、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江等地亦產(chǎn)，以遼寧的質(zhì)量為上佳。相關(guān)調(diào)查報(bào)告顯示，在白鮮皮品種的各產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量中，黑龍江占比為31.7%，遼寧占比為25.0%，吉林占比為15.0%，內(nèi)蒙古占比為15.0%，其他產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量占比為13.3%。

目前關(guān)于白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且相關(guān)報(bào)道也較少。本研究參照《中藥配方顆粒管理辦法》（征求意見稿）和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定要求》（征求意見稿）的相關(guān)要求，將采集的5個(gè)產(chǎn)地的白鮮皮15批藥材制成飲片，通過標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備，對有效成分含量、轉(zhuǎn)移率、出膏率范圍進(jìn)行考察，并進(jìn)行了指紋圖譜研究，以期提高白鮮皮配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的應(yīng)用和其他根莖類飲片的研究提供參考。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

Shunliu-12N冷凍干燥機(jī)，南京順流儀器有限公司提供；DHG-9140A熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、太倉精宏儀器設(shè)備有限公司提供；LC-20AT高效液相色譜儀，島津儀器設(shè)備有限公司提供；Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。

1.2 試藥

梣酮標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111700-201603）、黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111923-201604）、白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號：111828-201604），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

采集了5個(gè)產(chǎn)地的15批白鮮皮藥材，按2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定將白鮮皮藥材制成飲片，15批白鮮皮飲片信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

稱取白鮮皮飲片100 g，加水煎煮2次。第1次加水1 000 mL、浸泡30 min、煎煮20 min（沸騰后開始計(jì)時(shí)），第2次加水800 mL、煎煮15 min（沸騰后開始計(jì)時(shí)），合并煎液，用0.075 mm（200目）篩網(wǎng)趁熱過濾，將濾液迅速冷卻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（65 ℃，-0.09 MPa）濃縮至適合凍干的流浸膏，用冷凍干燥機(jī)干燥，得到標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末[3-7]。

2.2 白鮮皮飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中黃柏酮及梣酮含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水（二者體積比為60︰40）為流動(dòng)相，檢測波長為236 nm，理論板數(shù)以梣酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3 500。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別取黃柏酮、梣酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1.0 mL各含黃柏酮0.09 mg、梣酮0.06 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

1）白鮮皮飲片供試品溶液

取本品粗粉（過4號篩）1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）60 min，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2）白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液

精密量取濃縮至適宜程度的白鮮皮濃縮液5.0 mL，置于20 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[8-15]。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液2.0，6.0，10.0，12.0，16.0，20.0 μL，注入液相色譜儀，以黃柏酮、梣酮的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，測定的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：黃柏酮在0.238 0～2.380 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=16 122X+4 568，r=0.999 8；梣酮在0.129 0～1.290 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=223 583X- 5 204，r=0.999 9。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得黃柏酮、梣酮精密度的RSD值分別為0.28%和0.36%，均小于2%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12，18 h時(shí)測定黃柏酮、梣酮含量，計(jì)算黃柏酮、梣酮色譜峰的相對峰面積（relative peak area，RPA）及相對保留時(shí)間（relative retention time，RRT）。結(jié)果顯示，RPA的RSD值分別為0.52%和0.77%，RRT的RSD值分別為0.19%和0.22%，說明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末樣品6份，按2.3項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算黃柏酮、梣酮色譜峰的RPA及RRT。結(jié)果顯示，RPA的RSD值分別為1.30%和1.56%，RRT的RSD值分別為0.23%和0.15%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn)

取同一批已知含量的標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末樣品6份，每份約0.3 g，分別按樣品含量的80%，100%和120%加入黃柏酮、梣酮對照品，按供試品溶液制備方法制備，依照上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算其加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.2.9 飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定

按照2.2項(xiàng)所述方法，測定15批飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑白鮮皮中的黃柏酮、梣酮含量，結(jié)果見表3。

2.3 出膏率及梣酮、黃柏酮含量轉(zhuǎn)移率

根據(jù)實(shí)際凍干得到膏粉量，計(jì)算各批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率；根據(jù)膏粉和飲片中黃柏酮、梣酮含量，計(jì)算各批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中黃柏酮、梣酮含量的轉(zhuǎn)移率，見表4。

結(jié)果顯示：15 批白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為20.56%～34.42%，平均出膏率為29.05%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.34%；梣酮轉(zhuǎn)移率為22.63%～32.86%，平均轉(zhuǎn)移率為27.94%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56%；黃柏酮轉(zhuǎn)移率為25.08%～44.08%，平均轉(zhuǎn)移率為34.79%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.37%。

3 白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜測定

3.1 色譜條件

色譜柱為日本GL Science公司InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度條件見表5，檢測波長為228 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

3.2 對照品溶液的制備

分別取黃柏酮、梣酮、白鮮堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1.0 mL含黃柏酮0.10 mg、梣酮0.06 mg、白鮮堿0.10 mg的混合溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取凍干粉1.0 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，取出后放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾（過0.45 μm膜），取續(xù)濾液，即得[16-20]。色譜圖見圖1。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度考察

按“3.3”項(xiàng)方法制備同一批供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以黃柏酮為參比峰，計(jì)算其他主要色譜峰的RRT及RPA。結(jié)果顯示，RRT的RSD值為0.59%，RPA的RSD值為1.80%，相似度為1.00，說明儀器的精密度良好。

3.4.2 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，按3.1項(xiàng)色譜條件，分別在0，2，4，6，10，12 h時(shí)測定，記錄色譜圖，以黃柏酮為參比峰，計(jì)算其他各共有峰的RRT及RPA。結(jié)果顯示，RRT的RSD值為0.35%，RPA的RSD值為2.8%，相似度>0.99，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.3 重復(fù)性考察

取同批標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末樣品制備6份，按3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以黃柏酮為參比峰，計(jì)算其他各主要色譜峰的RRT及RPA。結(jié)果顯示，RRT的RSD值為0.82%，RPA的RSD值為2.50%，相似度為1.00，說明該方法的重復(fù)性良好。

3.5 樣品檢測與分析

取經(jīng)凍干的15批白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末，選用3.1項(xiàng)方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液；再選用

3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。將得到的15批供試品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）中，采用自動(dòng)匹配法生成共有模式對照圖譜，分析各樣品之間的共有峰和相似度，確定共有峰。結(jié)果顯示，15批樣品共有10個(gè)共有峰，見圖2，其中S001—S015為白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑， R為白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜。

以黃柏酮色譜峰為參照，計(jì)算10個(gè)共有色譜峰的相對峰面積及相對保留時(shí)間，見表6和表7，指紋圖譜相似度均在0.92以上，具體結(jié)果見表8。

4 討 論

4.1 流動(dòng)相選擇

先后考察了乙腈-0.1%的磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%的磷酸水溶液、甲醇-水不同流動(dòng)相梯度洗脫條件，綜合考慮色譜圖的基線、分離度、數(shù)目及峰面積，得出以乙腈-0.1%的磷酸水溶液梯度洗脫條件為最優(yōu)。

4.2 柱溫考察

先后考察了25，30，35 ℃共3個(gè)柱溫條件，結(jié)果顯示以30 ℃柱溫的分離效果最好。

4.3 干燥方式考察

先后采用冷凍干燥、60 ℃真空干燥和100 ℃干燥3種方式。結(jié)果顯示，黃柏酮含量分別為3.80，3.75，2.98 mg/g，梣酮含量分別為0.95，0.90 0.76 mg/g，與15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜相比，相似度分別為0.997，0.991和0.899。結(jié)果表明：冷凍干燥和60 ℃真空干燥，膏粉含量及指紋圖譜的變化不大；100 ℃干燥膏粉含量顯著下降，指紋圖譜差異很大，有些成分消失，故干燥溫度不宜過高。

4.4 加水量考察

先后考察了加水量分別為8/6倍、10/8倍、12/10倍及16/14倍的幾種情況。結(jié)果顯示：出膏率分別為25.23%，28.15%，29.22%及30.11%；黃柏酮轉(zhuǎn)移率分別為24.27%，25.07%，25.71%及25.98%；梣酮轉(zhuǎn)移率分別為26.86%，27.21%，28.11%及28.68%。標(biāo)準(zhǔn)湯劑中梣酮、黃柏酮轉(zhuǎn)移率和出膏率呈增長趨勢。

4.5 煎煮時(shí)間考察

先后考察了煎煮時(shí)間分別為15/10 min，20/15 min，30/20 min及40/30 min的幾種情況。結(jié)果顯示：出膏率分別為27.79%，28.98%，29.62%及30.88%；黃柏酮轉(zhuǎn)移率分別為23.33%，25.56%，26.67%及26.99%；梣酮轉(zhuǎn)移率分別為24.86%，25.26%，26.11%及27.21%。標(biāo)準(zhǔn)湯劑中梣酮、黃柏酮轉(zhuǎn)移率和出膏率呈上升趨勢?？梢姡y(tǒng)一制備方法確有必要。

5 結(jié) 語

1）白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的最佳制備方法如下。稱取白鮮皮飲片100 g，第1次加入10倍的水，浸泡30 min，煎煮20 min，過濾；第2次加入8倍的水，煎煮15 min，過濾。合并2次提取液，濾液迅速冷卻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至適合凍干的流浸膏，用冷凍干燥機(jī)干燥，即得。結(jié)果顯示：15批白鮮皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為20.56%～34.42%，黃柏酮轉(zhuǎn)移率為25.08%～44.08%，梣酮轉(zhuǎn)移率為22.63%～32.86%；采用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行指紋圖譜測定，相似度大于0.92。

2）通過規(guī)范制備方法，從根本上保證了研究的規(guī)范性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一致性和可控性，為配方顆粒的規(guī)范生產(chǎn)提供了技術(shù)保證，保障臨床用藥的安全及療效。

3）中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑對于生產(chǎn)配方顆粒具有重要的指導(dǎo)作用，本文建立的白鮮皮飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝，質(zhì)量穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)可靠，可在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。今后還需根據(jù)功效的差異及飲片的特質(zhì)設(shè)計(jì)不同的煎煮時(shí)間，以保障用藥安全及臨床療效。

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