張靜巖 張煒 任風(fēng)芝 張雪霞 王海燕 孟令茹

摘要：為解決實(shí)際應(yīng)用中克拉維酸鉀峰與后相鄰雜質(zhì)的分離度達(dá)不到要求的問(wèn)題，建立了一種同時(shí)測(cè)定阿莫西林克拉維酸鉀片中阿莫西林和克拉維酸鉀含量的新方法，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）， Ultimate AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以pH值為4.4的0.05 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液為流動(dòng)相，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min ，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm 。結(jié)果表明：阿莫西林和克拉維酸鉀兩主峰與相鄰雜質(zhì)得到完全基線(xiàn)分離，分離度大于1.5；克拉維酸鉀對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.050 0～0.500 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 8），平均回收率（n=9）為100.14%，RSD值為0.24%；阿莫西林對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為0.100 0～1.000 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率（n=9）為100.45%，RSD值為017%。與原有的《中華人民共和國(guó)藥典》方法相比，新的阿莫西林克拉維酸鉀片含量測(cè)定方法專(zhuān)屬性好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠，可作為一種質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：色譜分析；阿莫西林；克拉維酸鉀；含量測(cè)定；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R9781+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx04013

阿莫西林克拉維酸鉀片是葛蘭素史克（GSK）公司研制的由阿莫西林三水化合物和克拉維酸鉀組方的復(fù)方制劑，屬于國(guó)家基本藥物[1-2]。其中阿莫西林為廣譜青霉素類(lèi)抗生素，克拉維酸鉀為競(jìng)爭(zhēng)性廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，兩者合用，可保護(hù)阿莫西林免受β-內(nèi)酰胺酶的水解，使對(duì)阿莫西林耐藥并產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌仍然對(duì)阿莫西林敏感，從而不影響阿莫西林的殺菌效果[3-4]，臨床上廣泛應(yīng)用于敏感菌引起的上呼吸道感染、下呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、軟組織及皮膚感染以及其他感染。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA） 明確規(guī)定在2018年底前需完成對(duì)“阿莫西林克拉維酸鉀片”及其原研制劑的一致性評(píng)價(jià)工作[5-9]。目第4期張靜巖，等：阿莫西林克拉維酸鉀片含量測(cè)定方法的改進(jìn)河北工業(yè)科技第35卷前，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)該藥品進(jìn)行了含量、雜質(zhì)和溶出曲線(xiàn)等對(duì)比研究?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《藥典》）2015版[10]所述方法在含量測(cè)定部分指出，記錄色譜圖譜應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致，但對(duì)分離度并未有具體的要求，而在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)克拉維酸鉀峰與后相鄰雜質(zhì)的分離度達(dá)不到要求。本文在《藥典》2015版分析方法及相關(guān)文獻(xiàn)＼[10-20＼]的基礎(chǔ)上，對(duì)阿莫西林克拉維酸鉀片含量的測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用水相柱對(duì)樣品組分進(jìn)行分離，通過(guò)色譜條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)純緩沖鹽相作為流動(dòng)相，從而達(dá)到綠色環(huán)保檢測(cè)的要求，操作簡(jiǎn)便，且最終的分離度符合要求，效果較好。

1主要儀器與試藥

Aglient 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司提供）；色譜柱Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技（上海）股份有限公司提供）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)提供）。

克拉維酸化學(xué)對(duì)照品（批號(hào)為130429-201307，含量為95.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；阿莫西林化學(xué)對(duì)照品（批號(hào)為130409-201011，含量為85.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品（批號(hào)為130588-201202，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；阿莫西林克拉維酸鉀片 （規(guī)格為0.375 g，批號(hào)為170201，170202，170203，自制）；水為超純水；磷酸二氫鈉（批號(hào)為20140728，優(yōu)級(jí)純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心提供）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為005 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液，取磷酸二氫鈉7.8 g，加水900 mL使之溶解，用10%磷酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至（4.4±0.1），加水稀釋至1 000 mL），檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣體積為20 μL，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，分離度不低于2.0，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2溶液的配制

阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液的配制：精密稱(chēng)取適量阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成0.8 mg/mL的溶液。

對(duì)照品溶液的配制：精密稱(chēng)取適量克拉維酸對(duì)照品和阿莫西林對(duì)照品，加水超聲溶解，制成含克拉維酸0.25 mg/mL和含阿莫西林0.50 mg/mL的溶液。

供試品溶液的配制：另取阿莫西林克拉維酸鉀10片，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量，加水超聲溶解，制成含克拉維酸0.25 mg/mL和含阿莫西林0.50 mg/mL的溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別精密吸取阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液、阿莫西林克拉維酸對(duì)照品溶液、供試品溶液，以及高溫、光照、酸堿和氧化的強(qiáng)制降解樣品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該色譜條件下，所有強(qiáng)降解產(chǎn)物與兩主峰分離度良好，未見(jiàn)輔料干擾，克拉維酸保留時(shí)間為9.82 min，阿莫西林保留時(shí)間約為21.75 min，輔料無(wú)吸收峰。表明該方法的專(zhuān)屬性良好。

2.4線(xiàn)性范圍考察

取克拉維酸對(duì)照品26.32 mg、阿莫西林對(duì)照品58.28 mg，精密稱(chēng)定，用超純水配制成含克拉維酸0500 1 mg/mL和含阿莫西林1.000 1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液1，2，4，6和8 mL，分別置于10 mL量瓶中，用超純水稀釋定容至刻度，搖勻，得到克拉維酸質(zhì)量濃度分別為005，010，020，030，040，050 mg/mL和阿莫西林質(zhì)量濃度分別為010，020，040，060，080，100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到克拉維酸的線(xiàn)性方程為A=36 136 625.041 1C+112 292.364 4（r=0.999 8） ，表明克拉維酸在質(zhì)量濃度為0.050 0～0.500 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好；阿莫西林的線(xiàn)性方程為A=29 999 898.274 0C+64 788.391 8（r=0.999 9），表明阿莫西林在質(zhì)量濃度為0100 0～1000 1 mg/mL時(shí)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5回收率試驗(yàn)

按處方比例稱(chēng)取輔料和阿莫西林原料制成的無(wú)克拉維酸鉀的空白輔料，分成9等份，3 份為一組，分別精密加入一定量的克拉維酸鉀對(duì)照品，充分混

合均勻后置于100 mL 量瓶中，按“2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。按處方比例稱(chēng)取輔料和克拉維酸鉀原料制成的無(wú)阿莫西林的空白輔料，分成9等份，3 份為一組，分別精密加入一定量的阿莫西林對(duì)照品，充分混合均勻后置于100 mL 量瓶中，按“2.1”項(xiàng)所述方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

取阿莫西林對(duì)照品適量，加入超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.101 1 mg/mL的溶液，然后逐步稀釋至原質(zhì)量濃度的1/100 ，1/500 ，1/1 000，1/5 000 ，1/10 000，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，最小檢出限為10.11 ng/mL（S/N=3），最小定量限為20.22 ng/mL（S/N=10）。

取克拉維酸鉀對(duì)照品適量，加入超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的溶液，然后逐步稀釋至原質(zhì)量濃度的1/100 ，1/500 ，1/1 000，1/2 000，1/5 000，1/10 000，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得最小檢出限為10.04 ng/mL（S/N=3），最小定量限為50.20 ng/mL（S/N=10）。

2.7精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)同一對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，以相應(yīng)的色譜峰的面積計(jì)算RSD值，阿莫西林為0.15%、克拉維酸為0.07%（n=6），結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取阿莫西林克拉維酸鉀片樣品（規(guī)格為0.375 g，批號(hào)為170201），配制成供試樣品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)所述色譜條件重復(fù)測(cè)定阿莫西林和克拉維酸鉀含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），結(jié)果見(jiàn)表4 。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同批阿莫西林克拉維酸鉀片樣品（規(guī)格為 0375 g，批號(hào)為170201），按“2.2”項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0，2，4，6和8 h進(jìn)樣分析，記錄供試品溶液各色譜圖的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3樣品測(cè)定

按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算克拉維酸鉀和阿莫西林的含量，分別用新方法和《藥典》方法對(duì)3批樣品的含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表6和表7所示。比較表6和表7中2種方法的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新方法中主峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度大于1.5。

4結(jié)語(yǔ)

1）本文所述新方法采用Ultimate AQ-C18色譜柱、純緩沖鹽A相作為流動(dòng)相進(jìn)行等梯度洗脫，減少了有害溶劑的使用，將對(duì)人體的傷害降到最低，達(dá)到了綠色環(huán)保檢測(cè)的效果。

2）克拉維酸鉀尾部雜質(zhì)被完全分離出，與相鄰雜質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)完全基線(xiàn)分離，且克拉維酸鉀峰與其前鄰雜質(zhì)峰的分離度達(dá)到3.8，與其后雜質(zhì)峰的分離度達(dá)到5.0；阿莫西林主峰與其前峰的分離度達(dá)到23，與其后峰的分離度達(dá)到7.9，均優(yōu)于《藥典》條件。

3）按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算克拉維酸鉀和阿莫西林的含量，新方法中主峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度大于1.5，較好地解決了《藥典》方法峰型拖尾和分離度不好等問(wèn)題。新方法的專(zhuān)屬性好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠，可作為質(zhì)量控制方法。

4）本研究雖然相比《藥典》方法分離度好，使用的溶劑綠色環(huán)保，但尚存在不足之處，如分析時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致分析效率較低。未來(lái)需要在縮短分析時(shí)間方面加以深入研究，建議采用UPLC進(jìn)行分析，因?yàn)樵诜蛛x色譜峰時(shí)，UPLC的分離度高出HPLC 1倍，甚至更多，分析時(shí)間也縮短為HPLC的1/3，分辨率和靈敏度也能得到有效提高[21]。在條件允許的情況下，采用UPLC對(duì)該品種進(jìn)行分析將是不錯(cuò)的選擇。

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