樊繼鵬　余秀娟　徐振東等

[摘要]建立一種測定面制品中品質(zhì)改良劑偶氮二甲酰胺的降解產(chǎn)物——氨基脲（SEM）的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用LC-MS/MS法，將面制品通過低溫冷凍干燥，研磨后選擇乙酸乙酯做提取劑，40℃超聲30min，采用ESI+正離子質(zhì)譜電離模式，乙腈-0.3%乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫，該方法y=0.046 8x+0.0117在1.0～100.0μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性特征，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，檢出限LOD=0.25 μg/kg，其樣品加標(biāo)回收率為81.2%～92.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.9%～6.8%，說明該方法可行。同時，從危害識別、暴露評估、風(fēng)險描述等角度對面制品中SEM潛在安全風(fēng)險進行分析。

[關(guān)鍵詞]面制品；氨基脲；偶氮三甲酰胺；風(fēng)險；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：TS211.7 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180210

SEM是一種與硝基呋喃類藥物——呋喃西林代謝產(chǎn)物一致的化合物，具有致突變和致癌作用，常作為呋喃西林的代謝物在獸藥殘留中被檢出。近年來，研究發(fā)現(xiàn)面粉制品所添加品質(zhì)改良劑ADA經(jīng)過濕潤和熱加工處理后發(fā)生降解產(chǎn)生SEM。我國農(nóng)業(yè)部公告（560號）將呋喃西林及其鹽、酯及制劑列入獸藥名單。歐盟早已禁止使用ADA作為面粉處理劑，而我國GB 2760-2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定小麥粉中ADA最大使用量為45mg/kg。

目前，國內(nèi)對于SEM的測定一般采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，并無面制品中SEM的檢測標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于面粉熟食制品中呋喃西林代謝產(chǎn)物SEM的研究報道也比較少。因此，為更好解決面粉及制品中ADA與SEM間轉(zhuǎn)化關(guān)系以及二者之間轉(zhuǎn)化的數(shù)量關(guān)系，十分有必要建立一種面粉及其制品中SEM的檢測方法。同時，針對SEM作為品質(zhì)改良劑ADA在面制品中降解產(chǎn)物，因其致癌、致畸等危害性，對其食用過程中的安全性進行風(fēng)險分析，以期為面制品行業(yè)的有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料與試劑

面粉（蘇州市售）；丙酮（HPLC級）；正己烷（HPLC級）；乙酸銨（HPLC級）；ADA標(biāo)準(zhǔn)品；SEM標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Erenstorfer）；呋喃西林代謝物標(biāo)記物¹³C，¹⁵N-SEM（內(nèi)標(biāo)）：Witega；甲醇，乙酸乙酯、乙腈、正己烷為色譜純；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鄰硝基苯甲醛均為分析純；有機相濾膜（尼龍膜，0.22μm）。

1.2儀器與設(shè)備

AB 4500液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；Organomation N-EVAP氮吹儀；IKA渦旋混合器；Milli-Q超純水系統(tǒng)（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；（Hermle）Z 233M2微量高速型離心機（上?？推潓嶒瀮x器設(shè)備有限公司）；HWS系列恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Mettler-Toledo精密電子天平（梅特勒-托利多公司）；H2050R Cence高速離心機（湖南湘儀公司）；MM 400冷凍混合球磨儀（德國RETSCH公司）。

1.3試驗方法

1.3.1樣品處理

1.3.1.1面粉、生干性面制品

水解和衍生化：將樣品粉碎混勻，稱取5.0g（精確到0.001g）至50mL具塞比色管中，加入10mL0.2mol/L的鹽酸溶液，10000r/min渦旋30s，加入適量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液和10mL 0.1mol/L的鄰硝基苯甲醛-甲醇溶液，渦旋30s，40℃水浴中超聲30min。取出樣品冷卻至室溫，10000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。

提取和凈化：向上清液中加入5mL 0.1mol/L的K₂HPO₄，用1mol/L和0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.5（±0.2）。加入10mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5min，6 000r/min離心5min，吸取上清液。10mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯層，45℃下氮吹濃縮至近干。在殘留物中準(zhǔn)確加入5mL 0.3%乙酸水-乙腈（7/3，V/V）溶液溶解，渦旋30s，加入3mL正己烷，超聲1min，10000r/min離心5min，下層水相經(jīng)0.22 μn微孔濾膜過濾后供儀器分析。

1.3.1.2生濕性面制品和發(fā)酵性面制品

該類樣品先去餡后切細(xì)，經(jīng)攪拌機絞碎、混勻，稱取5.0g（精確到0.001g）至50mL具塞比色管中，剩余方法同1.3.1.1。

1.3.1.3其他類面制品

主要針對基質(zhì)相對復(fù)雜、粘彈性大無法研磨充分的面制品，該類面制品后期提取過程中易造成提取不充分。取該類樣品中的待測部分，先用冷凍干燥器干燥（稱量干燥前后的樣品質(zhì)量），然后將干燥后樣品粉碎混勻，稱取5.0g至50mL具塞比色管中，剩余方法同1.3.1.1。

1.3.2色譜條件

1.3.2.1 ADA色譜條件

色譜柱：氰基CN柱4.6mm×250mm 5um，流動相等度洗脫：20.0mmol/L乙酸銨：乙腈=98：2，柱溫：30℃，流速：0.8ml/min，檢測波長：245nm，進樣量：10μl。

1.3.2.2 SEM色譜條件

（1）色譜條件：色譜柱Waters，C₁₈，3.5μm×2.1μm×150mm；柱溫30℃；流動相A為0.3%乙酸酸水溶液，流動相B為0.3%乙酸乙腈溶液；梯度洗脫0：00min，A90%-7：00min，A10%-9：00min，A10%-9：01min，A90%-10：00min，A90%；流速為0.2mL/min。

（2）質(zhì)譜條件：電離源模式，電噴霧離子源（eleetrospmy ionization，ESI）；電離源極性：正模式（ESI+）；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reactions monitoring，MRM）；電噴霧電壓，5000V；霧化氣壓力，60.0psi；輔助氣壓力，60.0psi；氣簾氣壓力35.0psi；干燥氣溫度，480℃；其他質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

1.4實驗內(nèi)容

1.4.1條件的優(yōu)化

參照1.3.1樣品處理方法及1.3.2色譜條件，樣品經(jīng)加標(biāo)后采用3水平6平行實驗，進行檢測分析，以確定分析條件的可行性。

1.4.2面制品中ADA其降解產(chǎn)物SEM安全風(fēng)險分析

通過面制品中ADA的降解途徑、ADA及其SEM的風(fēng)險識別、安全風(fēng)險評估、實際SEM的污染情況、暴露評估以及該類品質(zhì)改良劑的風(fēng)險管理建議及措施，對面制品中ADA其降解產(chǎn)物SEM安全風(fēng)險進行分析。

1.4.3數(shù)據(jù)處理

各指標(biāo)值測定均重復(fù)6次（n=6），用excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，用SAS 9.0軟件進行Duncan新復(fù)極差分析。

2結(jié)果與分析

2.1方法線性范圍和檢出限

選擇陰性樣品，按照終濃度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/kg加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進行相同的水解、衍生、提取、凈化步驟，制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在陰性基質(zhì)中進行加標(biāo)實驗，按信噪比3：1確定檢出限，信噪比10：1確定定量限。待測液和標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子峰保留時間一致（±0.5%），對應(yīng)質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)品一致，其豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品相比應(yīng)：相對豐度>50%時，允許±10%偏差；相對豐度20%～50%時，允許±15%偏差；相對豐度10%～20%時，允許±20%偏差；相對豐度≤10%時，允許±50%偏差，此時可定性確證目標(biāo)分析物。SEM衍生物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及SEM的檢出限數(shù)據(jù)如表2所示。

圖1是在上述色譜條件下，2-NBA-SEM液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，詳細(xì)變化過程如圖1所示。

圖2是在上述色譜條件下，SEM和¹³C，¹⁵N-SEM標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇離子色譜圖，詳細(xì)對照圖如圖2所示。

2.2方法的回收率和精密度

選取市售面制熟食，參照1.3.1樣品處理方法及1.3.2色譜條件，樣品經(jīng)加標(biāo)后采用3水平6平行實驗，通過不同濃度加標(biāo)及重復(fù)性實驗，回收率、精密度如表3所示。

由表3數(shù)據(jù)可知，通過基質(zhì)加標(biāo)，進行3水平6平行試驗，所得SEM的加標(biāo)回收率為81.2%、86.5%、92.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.8%，其檢測結(jié)果符合GB/T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范中食品理化檢驗的要求。

2.3面制品中ADA其降解產(chǎn)物SEM安全風(fēng)險分析

ADA的毒性為“一般認(rèn)為安全”（GRAS），我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2011）中規(guī)定：小麥粉中ADA的最大使用量為0.045g/kg。但研究表明，ADA在濕潤、酸性等條件下能夠迅速轉(zhuǎn)變成聯(lián)二脲（B1U），再經(jīng)過蒸、烤等高溫處理，BIU又能夠轉(zhuǎn)變成氨基脲（SEM）和尿唑（Urazole），而SEM是公認(rèn)的致癌物。本研究通過闡釋特定熱加工條件對面制品中ADA及其降解產(chǎn)物進行風(fēng)險識別、評估，并在前期動力學(xué)降解實驗研究的基礎(chǔ)上，核算ADA降解為SEM的轉(zhuǎn)趨規(guī)律，從保障食品安全和食品貿(mào)易的角度提出風(fēng)險管理建議。

2.3.1 ADA及其SEM的風(fēng)險識別

從毒理學(xué)的角度來說，ADA為GRAS，小鼠口服LD50>10g/kg，日容許攝入量ADI為0～45mg/kg（FAO/WHO，1985），此范圍內(nèi)被認(rèn)為無毒。

SEM的LD50為225 mg/kg，急性毒性表現(xiàn)為吸人染毒，皮膚接觸、入眼都有危險，導(dǎo)致過敏、充血等；其慢性毒性表現(xiàn)為反復(fù)長期暴露在含有少量SEM的空氣中，造成暴露部位的過敏反應(yīng)，

SEM具有潛在的毒性及致癌、致畸性，主要表現(xiàn)出：具有一定程度的神經(jīng)毒性，通過抑制谷氨酸脫羧酶（GAD），干擾神經(jīng)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致一些認(rèn)知功能的缺失；對于不同類型的離體細(xì)胞均具遺傳毒性；對動物組織器官均能產(chǎn)生多效性影響；在無細(xì)胞系統(tǒng)中，SEM能與RNA的胞嘧啶殘留物、DNA的脫氧胞嘧啶殘留物及胞嘧啶和脫氧胞嘧啶核苷連接，從而引起細(xì)胞染色體的損傷?？梢钥闯觯姘蠥DA及其降解產(chǎn)物中造成食品安全風(fēng)險的主要物質(zhì)是SEM。

2.3.2 SEM安全風(fēng)險評估

研究發(fā)現(xiàn)，影響面制品中ADA降解的主要因素是濕度和溫度，通過模擬烘烤類面制品加工工藝，在面粉中添加ADA濃度為45 mg/kg，分別在和面15 min后（濕度為78%），溫度為35℃發(fā)酵2.5 h，再在180℃下烘烤20 min過程中檢測ADA和SEM含量，考察加工過程中ADA-SEM轉(zhuǎn)趨規(guī)律，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，經(jīng)加工后，整體烘烤類面制品中ADA已基本降解，但在三種過程中實際測得SEM的平均含量僅分別為12.18、20.85、706.55ug/kg，ADA-SEM的轉(zhuǎn)化率分別為0.04%、0.05%、1.57%。當(dāng)按照ADA最大使用量（45mg/kg）添加時，降解產(chǎn)物SEM的含量已超過歐盟1.0μg/kg的最低檢測靈敏度要求。

2.3.3 SEM的污染情況調(diào)查

分別從大型超市、面包店、食品雜貨店和淘寶網(wǎng)店購買了20個面包樣品，進行了SEM污染情況的調(diào)查，結(jié)果如表5所示。

由表5中可知，80個樣品中有66個檢出SEM，陽性率為82.5%，SEM含量在5.82～1058.250g/kg之間，平均值為166.95 μg/kg，與Becalski等的調(diào)查結(jié)果接近?？梢?，ADA作為面粉改性劑不同渠道銷售的面包中普遍使用，導(dǎo)致市售面包中SEM污染。

2.3.4 ADA與SEMD暴露評估

ADA的ADI值為0～45mg/kg，60kg的成人日允許攝入量為0～270mg。成人若每日食用500g面包，按照我國GB 2760-2011標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，小麥粉中ADA最大使用量為45mg/kg，則日攝入ADA最多為22.5mg，在允日許攝入量范圍之內(nèi)，攝入ADA本身并不帶來危害。由于ADA暴露于易感人群的途徑是在面粉加工過程中，ADA粉末容易引起肺部和皮膚的急性過敏反應(yīng)，吸入ADA粉末能導(dǎo)致哮喘和氣急等疾病。因此，建議日常接觸大量ADA的人員，在工作期間應(yīng)佩戴過濾口罩、穿防護服作業(yè)。

ADA的降解產(chǎn)物SEM對公眾的主要暴露途徑是食用受其污染的食品。本研究中結(jié)果顯示，45mg/kg ADA制作面包，整體面包樣品中測得SEM的平均含量為706.55 μg/kg。按此計算，體重為60kg的成人若每日食用500g面包，則SEM的暴露量為5.88μgkg-bw/day，已超過EFSA規(guī)定的2g/kg-bw/day的“合理的最壞情況”。由此可見，按照45mg/kg的最大允許添加量添加ADA，產(chǎn)生SEM的量已可能危害公眾健康，需要引起足夠的重視。

2.3.5風(fēng)險管理建議及措施

本研究結(jié)果及諸多文獻報道均已證實面粉中添加ADA會降解產(chǎn)生危害物質(zhì)SEM，并且按最大允許添加量（45mg/kg）添加ADA，產(chǎn)生SEM的量已超過EFSA的相關(guān)規(guī)定。從食品安全和確保消費者身體健康的角度，建議禁止繼續(xù)使用ADA作為面粉添加劑。

本研究發(fā)現(xiàn)ADA降解為SEM的轉(zhuǎn)化率1.57%計算，若要符合歐盟規(guī)定的SEM最低檢測靈敏度要求（1.0μg/kg），ADA的使用量應(yīng)控制在63.69μg/kg以內(nèi)；若要符合日本“肯定列表制度”的最低檢測靈敏度要求（0.5μg/kg），則ADA的使用量應(yīng)控制在31.85μg/kg以內(nèi)。按這種濃度水平添加，ADA已起不到添加劑作用。因此，從降低貿(mào)易糾紛的角度，也應(yīng)該禁止在面粉中添加ADA。

ADA作為面粉添加劑仍然存在廣泛爭議，包括我國在內(nèi)的一些國家仍然允許其使用。但考慮到在面粉加工過程產(chǎn)生降解產(chǎn)物（主要SEM）的危害性，本研究在測定方法的研究基礎(chǔ)上，闡釋了面包中ADA的降解途徑和轉(zhuǎn)化規(guī)律，對面包中的ADA及其降解產(chǎn)物進行了風(fēng)險評估。同時從保障食品安全和食品貿(mào)易的角度，提出在面粉中禁止添加ADA的風(fēng)險管理建議，以供相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈和相關(guān)管理機構(gòu)參考。

3結(jié)論

（1）建立一種面粉及其制品中SEM的LC-MS/MS檢測方法，針對面制品不同物性，采取了不同類預(yù)處理方式，采用衍生化和固液萃取及液液萃取法實現(xiàn)對SEM的檢測，即選擇乙酸乙酯做提取劑，40℃超聲30min，采用ESI+正離子質(zhì)譜電離模式，乙腈-0.3%乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫，其目標(biāo)物不僅達到完全分離而且峰形良好，保留時間合理。同時，通過實驗驗證，該方法y=0.046 8x+0.0117在1.0～100.0μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性特征，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，檢出限LOD=0.25μg/kg，其樣品加標(biāo)回收率為81.2%～92.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.9%～6.8%，該方法靈敏度高、精密度和準(zhǔn)確度均符合要求，能夠滿足面粉及其制品中SEM的檢測要求。

（2）針對面制品中品質(zhì)改良劑ADA的降解產(chǎn)物SEM安全進行了分析研究，ADA在歐盟、澳大利亞、新加坡和日本和三聚氰胺、蘇丹紅一樣都被列為非法添加物，而我國GB 2760-2014中規(guī)定：小麥粉中ADA的最大使用量為0.045g/kg。本研究通過模擬烘烤面制品制作工藝，考察其制作過程（和面、發(fā)酵）及烘烤過程各指標(biāo)的轉(zhuǎn)化情況，得到烘烤過程中ADA-SEM的轉(zhuǎn)化率為1.57%，按我國ADA最大使用量添加時，降解產(chǎn)物SEM的含量已超過歐盟1.0μg/kg的最低檢測靈敏度要求。結(jié)合抽樣檢測結(jié)果：對80個樣品中有66個檢出SEM，陽性率為82.5%，SEM含量在5.82～1058.25μg/kg，平均值為166.95μg/kg，由此可見，ADA作為面粉改性劑，在不同渠道銷售的面包中普遍使用。同時，實驗以45mg/kg ADA制作面包，整體面包樣品中測得SEM的平均含量為706.55μg/kg。按此計算，體重為60kg的成人若每日食用500g面包，則SEM的暴露量為5.88μg/kg-bw/day，已超過EFSA規(guī)定的2g/kg-bw/day的“合理的最壞情況”。