依拉古 格格日勒 那生桑

摘要 目的：對(duì)蒙藥手參藥材和奶手參（奶制飲片）進(jìn)行系統(tǒng)性生藥學(xué)鑒定及分析，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及鑒定提供科學(xué)依據(jù)。方法：參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版附錄）相關(guān)方法，對(duì)手參藥材和奶手參的水分，灰分及浸出物進(jìn)行測(cè)定；采用顯微，薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別。以天麻素為對(duì)照品，用70%甲醇提取，以乙酸乙酯-甲酸-水（9∶1∶0.2）為展開劑，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法對(duì)手參與奶手參中的多糖及天麻素進(jìn)行含量分析。色譜柱為ZOBB AX eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 cm）柱；以甲醇-0.04%的磷酸溶液（8∶92）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm；柱溫30 ℃。結(jié)果：薄層色譜法試驗(yàn)中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。高效液相色譜條件下天麻素被洗脫且達(dá)到基線分離，天麻素在濃度0.009～0.09 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=586866X+425821（R=0.9996），平均回收率為100.1%。精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求。三批樣品浸出物結(jié)果為26.13%～42.58%，水分為3.47%～5.31%，總灰分為5.43%～6.33%。結(jié)論：質(zhì)控方法可靠，靈敏度高，專屬性，準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好。該結(jié)果對(duì)手參藥材鑒定、資源利用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升，提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 蒙藥；手參；顯微鑒別；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

Abstract Objective：To carry out a systematic pharmacognostical study on Shoushen and Naishoushen， and to provide the basis for establishing its quality standard and appraisal. Methods：Based on the methods recorded in appendix of Pharmacopoeia of the People′s Republic of China （2010 edition， volume1）， the water content， total ash and ethanol-soluble extractives of the crude drugs were detected. The microscopy TLC was used for qualitative identification. With gastrodin as control agent， 70% methyl alcohol was used to extract. With ethyl acetate formic acid-water （9∶1∶0.2） as developing solvent， 10% phosphomolybdic acid ethanol solution was sprayed. And at 105 ℃ heated until spot color was clear. By ultraviolet-visible spectrophotometry and HPLC method were used for the determination of contents of the polysaccharides and gastrodine of Shoushen and Naishoushen. Chromatographic column for ZOBB AX eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 cm）； methanol-water （0.04% phosphoric acid） （8∶92） was used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was at 222 nm. Results：In thin layer chromatography （TLC）， the same color spots were detected in the corresponding positions of the chromatography. HPLC was used to elute the gastrodine and achieve the baseline separation. The concentration of gastrodine in the concentration range 0.009～0.09 mg/mL was good. And the regression equation was Y=586866X+425821 （R=0.9996） and the average recovery was 100.1%. Precision test， repeatability test， stability test were in line with the requirements. Three batches of sample extract was 26.13%～42.58%， water 3.47%～5.31% and total ash content was 5.43%～6.33%. Conclusion：The indictment method is reliable， sensitive， specific， accurate and stable. The results provide scientific basis for identification， resource utilization and improvement of quality standards.

Key Words Mongolian medicine； Shoushen； Microscopic identification； TLC； HPLC； Quality standard

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.054

手參為蘭科多年生草本植物手掌參Cymnadenia conopsea P.Br.的塊莖，因藥用部分類似手掌而故名。異名為“旺拉嘎”，春秋季采挖，曬干。其味甘、澀，性溫。有滋養(yǎng)體素，壯陽(yáng)，固精等多個(gè)功效[1-3]。主要分布于我國(guó)東北、華北、西北、四川[3]。手參作為蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥材，在多數(shù)滋補(bǔ)，壯陽(yáng)，延年益壽處方中不可缺乏。《蒙藥正典》中記載[4]：“手參分為兩大類，即手掌參和盤龍參。手掌參根有五指者佳，指越少質(zhì)越次。盤龍參根如手指并握狀，也有分一二手指的。功效比手掌參差”。手參塊莖中含化學(xué)成分較多，已分離鑒定的有氨基酸類，其中蘇氨酸含量最高[6]，苷類、脂類[7]、二氫類[8]等。手參作為蒙醫(yī)常用藥材具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。與五靈脂、石榴、黃精、黑冰片等37種藥材制成手參三十七味丸，具有治腎寒、生津壯陽(yáng)、滋補(bǔ)等功效[9]。與熊膽、冬蟲夏草、黃精等滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥配伍制成六味手參散，可治療滑精，陽(yáng)痿等癥[10]。與苦參等制成手參三味湯，用于治游痛癥，陶賴病[11]。

1 儀器與試藥

顯微鏡（光學(xué)顯微鏡，×400）；高效液相色譜儀（島津LC-204）；KQ-250DE型超聲清洗器；UV230+型紫外分光光度儀（大連伊力特牌）；電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；天麻素（批號(hào)：151130），三批手參藥材經(jīng)內(nèi)蒙古藥檢所鑒定為正品。甲醇（色譜純），水（超純水，蒸餾水），所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別試驗(yàn)

莖塊稍扁，形如手掌，長(zhǎng)1～4.5 cm，直徑1～3 cm，表面淺黃色或暗棕色，有細(xì)皺紋，頂端有莖殘基，其周圍有點(diǎn)狀根痕；下部有4～14指狀分枝，分枝長(zhǎng)0.3～2.5 cm，直徑2～8 mm。質(zhì)堅(jiān)硬，不易折斷，斷面黃白色，角質(zhì)樣。氣微，味淡，嚼之發(fā)黏；奶手參表面黃色或暗褐色。略具奶香氣，味淡。見圖1。

2.2 顯微鑒別

手參與奶手參粉末呈淺黃色，淀粉粒多見，不規(guī)則粘液質(zhì)團(tuán)塊眾多，加碘液試液呈紫藍(lán)色。草酸鈣針晶易見，在薄壁細(xì)胞中成束散在，長(zhǎng)8～65 μm。導(dǎo)管多梯紋、網(wǎng)紋，螺紋少見，直徑13～55 μm，薄壁細(xì)胞多，有的甚大。見圖2。

2.3 薄層色譜鑒別

供試品的制備 取1.0 g手參或奶手參粉末，加入70%甲醇5 mL，超聲處理30 min后過濾。將濾液蒸干，殘?jiān)尤?0%甲醇1 mL使完全溶解。

對(duì)照品溶液的配置 取天麻素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部附錄VI B薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述2種溶液點(diǎn)于同一個(gè)硅膠G薄層板上，展開劑為以乙酸乙酯-甲酸-水（9∶1∶0.2）。展開，取出，晾干后噴以10%磷鉬酸乙醇溶液進(jìn)行顯色，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。手參與奶手參藥材在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置，顯相同斑點(diǎn)。見圖3。

2.4 水分與總灰分

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅸ H烘干法和附錄Ⅸ K總灰分測(cè)定法試驗(yàn)測(cè)定水分和總灰分，結(jié)果見表1。

2.5 浸出物

根據(jù)手參化學(xué)成分，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版第一部附錄ⅩA的方法，以水為溶劑，冷浸法測(cè)定手參的浸出物含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.6 總糖、多糖和天麻素含量測(cè)定

2.6.1 總糖 照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》紫外-可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取烘干至恒的無(wú)水葡萄糖適量，加水制成每l mL含1.0 mg的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取葡萄糖溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于50 mL容量瓶，補(bǔ)蒸餾水至刻度。分別取上述溶液2 mL，置試管中并加入15%苯酚溶液1 mL，搖勻后加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，在40 ℃水浴鍋中放置30 min。以相應(yīng)試劑為空白，于490 nm處檢測(cè)吸光度，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定法：取約0.5 g手參或奶手參粉末（過六號(hào)篩），置圓底燒瓶中并加入50 mL水，加熱回流1 h，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量。過濾，取1 mL濾液置100 mL量瓶中并加水至刻度。精密量取25 mL于50 mL量瓶中，并補(bǔ)水至刻度。精密量取上述溶液2 mL于試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，加入1 mL苯酚溶液（15%），搖勻后迅速加入5.0 mL硫酸后在40 ℃水浴鍋中放置30 min。于490 nm處檢測(cè)吸光度值。

測(cè)定結(jié)果：3批手參藥材為17.5%～20.4%，均值為19.0；3批奶手參為17.9%～21.4%，均值為19.2%。

2.6.2 多糖

本品多糖含量通過測(cè)定樣品中還原糖含量，再通過總糖含量減去還原糖含量計(jì)算得到。

對(duì)照品溶液的制備：同上2.6.1相應(yīng)方法制備。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mL于試管中并加蒸餾水使成3 mL，加DNS試液2 mL，置沸水浴中加熱8 min。取出冷卻后至室溫，置10 mL容量瓶定容。按照紫外-可見分光光度法，在494 nm處檢測(cè)吸光度，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

還原糖的測(cè)定法：取約0.5 g手參或奶手參粉末（過六號(hào)篩），置圓底燒瓶中加入10倍數(shù)的水，搖勻，加熱回流1 h。放置冷卻后稱定質(zhì)量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的質(zhì)量。過濾，取濾液2.5 mL，于試管中，加水使成3 mL，加入DNS試液2 mL，置沸水浴中加熱8 min。取出后迅速冷卻至室溫用水定容至刻度。在494 nm處檢測(cè)吸光度值。多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

測(cè)定結(jié)果：3批手參藥材為14.2%～18.4%，均值為16.5%；3批奶手參為13.9%～17.4%，均值為15.65%。

2.6.3 天麻素

2.6.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性條件

色譜柱為ZOBB AX eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 cm）柱；以甲醇-0.04%的磷酸溶液（8∶92）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)222 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

2.6.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取天麻素對(duì)照品3.5 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

2.6.3.3 供試品溶液的制備 取1.5 g手參粉末，置圓底燒瓶中并加入15 mL水，加熱回流2 h，過濾，合并濾液。濃縮后置25 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，濾過，取濾液，即得。

2.6.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取天麻素對(duì)照品溶液1、3、5、7、10 mL置10 mL容量瓶，用甲醇定容。從中各取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=586 866X+425 821，R=0.999 6。結(jié)果表明天麻素對(duì)照品在濃度0.009～0.09 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖5。

2.6.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.6.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液液20 μL，按照2.6.3.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD為0.6%，表明儀器精密度良好[12]。

2.6.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.6.3.3項(xiàng)下的供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣20 μL，記錄6次的峰面積，計(jì)算其RSD為1.5%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批手參樣品，按2.6.3.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.6.3.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的手參樣品6份，每份0.75 mg。分別加入天麻素對(duì)照品適量，按照2.6.3.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液。平均回收率為100.1%，RSD為0.85%。

2.6.3.9 樣品含量測(cè)定

稱取1.5 g手參藥材樣品3份，按照2.6.3.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，平均含量2.22 mg/g。見表3。

3 討論

根據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道，目前手參的含量測(cè)定研究一般多以多糖[13]和鹽酸小檗堿[14]作為指標(biāo)，但小檗堿的主要藥理作用為殺菌，不符合手參蒙醫(yī)認(rèn)為的功能；多糖雖有免疫調(diào)節(jié)之作用，但是不穩(wěn)定，定量難度較大。本研究認(rèn)為作為蒙藥手參的含量測(cè)定，一方面要體現(xiàn)手參的功能，另一方面具備較為穩(wěn)定的理化性質(zhì)，且具專屬性。手參含天麻素量雖少，尤其在奶制手參飲片中含量不穩(wěn)定（經(jīng)探討，與藥材新鮮程度有關(guān)，可通過改善儲(chǔ)藏來(lái)解決）。天麻素具有抗驚厥、鎮(zhèn)痛、增加心腦血流量、抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶力等藥理作用[15]。故選用天麻素作為手參藥材含量指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定，很有現(xiàn)實(shí)意義。該方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，高效，因此可建立可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

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