黃傳俊 梅勇 楊莉 羅磊 曾博程 龍濤 袁開超 譙志文 陳小雪

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）12-1621-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.09

摘 要 目的：建立同時(shí)測定金蟬止癢膠囊中鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil BDS C18，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺（50 ∶ 30 ∶ 19 ∶ 1，V/V/V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為265 nm（鹽酸小檗堿）、280 nm（黃芩苷）、322 nm（蛇床子素），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為80～800 ng（r=0.999 8）、60～600 ng（r=0.999 9）、60～600 ng（r=0.999 6）；定量限分別為80、60、60 ng，檢測限分別為24、20、20 ng；中間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%；加樣回收率分別為97.4%～98.3%（RSD=0.33%，n=6）、98.4%～99.6%（RSD=0.42%，n=6）、96.9%～99.0%（RSD=0.92%，n=6）；耐用性試驗(yàn)的RSD均小于1.2%。結(jié)論：該方法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于金蟬止癢膠囊中鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素含量的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞 金蟬止癢膠囊；高效液相色譜法；鹽酸小檗堿；黃芩苷；蛇床子素；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of the content of berberine hydrochloride，baicalin and osthole in Jinchan zhiyang capsules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed in Hypersil BDS C18 column with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.1% phosphoric acid-three triethylamine （50 ∶ 30 ∶ 19 ∶ 1，V/V/V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 265 nm （berberine hydrochloride）， 280 nm （baicalin） and 322 nm （osthole）. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of berberine hydrochloride， baicalin and osthole were 80-800 ng（r=0.999 8）， 60-600 ng（r=0.999 9）， 60-600 ng（r=0.999 6）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The limits of quantitation were 80，60，60 ng， respectively， and the limits of detection were 24，20，20 ng， respectively. The recovery rates were 97.4%-98.3%（RSD=0.33%，n=6）， 98.4%-99.6%（RSD=0.42%，n=6） and 96.9%-99.0%（RSD=0.92%，n=6）， respectively. RSDs of durability tests were all lower than 1.2%. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable. It can be used for simultaneous determination of berberine hydrochloride，baicalin and osthole in Jinchan zhiyang capsules.

KEYWORDS Jinchan zhiyang capsules； HPLC； Berberine hydrochloride； Baicalin； Osthole； Content determination

金蟬止癢膠囊為純中藥制劑[1]，由金銀花、黃柏、黃芩、蛇床子、梔子、苦參、龍膽、白芷、白鮮皮、蟬蛻、連翹、地膚子、地黃、青蒿、廣藿香、甘草等16味中藥材組方而成，具有鎮(zhèn)靜、抗過敏、抗炎、解熱、抑菌、利尿、解毒等作用[2]。藥理研究表明，該藥對模型動(dòng)物非免疫性接觸性蕁麻疹癥狀改善作用明顯，并對多種原因?qū)е碌哪Ｐ托∈笃つw瘙癢癥狀具有良好的止癢作用[3-4]。臨床研究顯示，該藥治療神經(jīng)或內(nèi)分泌等因素引起的瘙癢[5]、慢性蕁麻疹[6]、濕熱型肛周濕疹[7]及其他各類濕熱型濕疹[8]等療效顯著。該藥處方中黃柏、黃芩、蛇床子與其清熱、解毒、止癢功效關(guān)系密切，因此保證上述藥材有效成分的含量，是保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。而該藥現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[9]中只測定了鹽酸小檗堿的含量。盡管現(xiàn)有文獻(xiàn)[1，10-11]報(bào)道了用高效液相色譜法（HPLC）分別測定中藥制劑中鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素的含量，但相關(guān)方法耗時(shí)長，不利于快速檢測。本課題組采用HPLC法同時(shí)測定金蟬止癢膠囊中鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素的含量，旨在為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030型HPLC儀，包括在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、LabSolutions色譜工作站和UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；CP225D型電子分析天平、BS124S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

金蟬止癢膠囊（重慶希爾安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170901、170902、170903，規(guī)格：0.5 g/粒）；鹽酸小檗堿對照品（批號(hào)：110713-201212，純度：86.7%）、黃芩苷對照品（批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%）、蛇床子素對照品（批號(hào)：110822-201406，供含量測定用）均購于中國食品藥品檢定研究院；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺（50 ∶ 30 ∶ 19 ∶ 1，V/V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：265 nm（鹽酸小檗堿）、280 nm（黃芩苷）、322 nm（蛇床子素）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加DMF 5 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min，加甲醇制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液。取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加DMF 5 mL，超聲處理5 min，加甲醇制成質(zhì)量濃度為300 μg/mL的黃芩苷對照品溶液。取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加DMF 5 mL，超聲處理5 min，加甲醇制成質(zhì)量濃度為300 μg/mL的蛇床子素對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加DMF 5 mL，超聲處理5 min，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按金蟬止癢膠囊處方和工藝分別制備缺黃柏、黃芩、蛇床子的單一陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成單一陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿、黃芩苷、蛇床子素計(jì)均高于4 000，分離度均大于2.0。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，陰性對照在與各待測成分保留時(shí)間相同處無色譜峰出現(xiàn)，表明本方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列單一對照品溶液。精密量取上述系列單一對照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素回歸方程分別為y=49 853x+630（r=0.999 8）、y=36 457x+230（r=0.999 9）、y=37 654x+985（r=0.999 6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為80～800、60～600、60～600 ng。

2.6 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測限。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素定量限分別為80、60、60 ng，檢測限分別為24、20、20 ng。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

取樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170901）約0.25 g，由不同分析人員于不同日期按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素峰面積的RSD分別為1.10%、0.94%、0.73%（n=6），表明本方法中間精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：170901）7份，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.80%、0.90%、0.90%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170901）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素含量平均值分別為1.12、0.24、0.21 mg/粒，RSD分別為0.92%、0.80%、0.79%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170901）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.11 耐用性試驗(yàn)

2.11.1 色譜柱考察 取樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170903）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[色譜柱分別為Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，色譜柱一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.11.2 流動(dòng)相考察 取樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170903）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流動(dòng)相甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺的體積比分別為48 ∶ 30 ∶ 20 ∶ 2、50 ∶ 30 ∶ 19 ∶ 1、51 ∶ 30 ∶ 18 ∶ 1）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，流動(dòng)相一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.11.3 流速考察 取樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170903）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（流速分別為0.9、1.0、1.1 mL/min）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，流速一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.11.4 柱溫考察 取樣品內(nèi)容物細(xì)粉（批號(hào)：170903）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（柱溫分別為25、30、35 ℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，柱溫一定程度波動(dòng)能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

2.12 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

在樣品提取方法上，本課題組分別考察了用鹽酸-甲醇（1 ∶ 100，V/V）超聲處理20 min、70%乙醇溶液超聲處理30 min和DMF超聲處理5 min的提取效果。結(jié)果表明，樣品采用鹽酸-甲醇（1 ∶ 100，V/V）超聲處理后，鹽酸小檗堿色譜峰峰形較好，但黃芩苷和蛇床子素峰形較差；采用70%乙醇溶液超聲處理后，黃芩苷和蛇床子素色譜峰峰形較好，但鹽酸小檗堿峰形較差；采用DMF超聲處理后，3種待測成分色譜峰峰形均較好。因此，選用DMF作為提取溶劑。

在色譜條件的選擇中，筆者分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液-三乙胺、甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺作為流動(dòng)相對結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺（50 ∶ 30 ∶ 19 ∶ 1，V/V/V/V）為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素色譜峰分別在265、280、322 nm波長處與相鄰峰之間分離度好，峰形尖銳、對稱性好，理論板數(shù)均大于4 000，各項(xiàng)參數(shù)能滿足HPLC法的相關(guān)要求。

綜上所述，本方法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于金蟬止癢膠囊中鹽酸小檗堿、黃芩苷和蛇床子素含量的同時(shí)測定。

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（收稿日期：2017-12-05 修回日期：2018-02-09）

（編輯：張 靜）