王蓓蓓 張 炎 金博文 王澤偉 李亦軒 趙 健 張金鳳

(北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室，林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，國家林業(yè)局樹木花卉育種與生物工程重點實驗室，生物科學與技術學院，北京 100083)

楊樹 (Populus) 具有分布廣泛、適應性強等優(yōu)點，是造林綠化和再生生物物質能源植株[1]。同時，具有基因組小、容易繁殖、生長迅速等特點，因此被認為是林木基因工程中的理想模式樹種[2-3]。自1987年白楊派 (Leuce) 轉基因成功以來，農桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens) 介導的楊樹，尤其是白楊遺傳轉化體系的研究取得了較大進展。研究表明，菌株、外植體的種類、預培養(yǎng)時間、侵染時間、乙酰丁香酮 (AS) 濃度、菌液OD600值、暗培養(yǎng)時間等因素均可影響轉化率[4-9]。歐美雜種山楊 (Populustremula×Populustremuloides) 是歐洲山楊和美洲山楊的雜交種，因具有抗寒性強、耐貧瘠等特點，成為我國北方山地造林的優(yōu)良樹種[10-11]，且其樹形高大，樹干通直，材質細密潔白，是造紙和建房木材等工業(yè)用材的優(yōu)質原料[12]。在白楊轉基因研究中，歐美雜種山楊被應用較早[13-14]，其中歐美雜種山楊353無性系離體再生體系已建立[15]，并被應用于轉FT1基因促進其早期開花的研究[16]。

隨著轉基因技術在生物技術及商業(yè)領域的應用，其外源基因逃逸所帶來的安全性問題一直受到公眾的普遍關注。目前，借助外源基因刪除系統(tǒng)、葉綠體轉化法、雄性不育法、終止子法、染色體組特異性選擇[17]等技術有望解決這一問題。但葉綠體轉化法可適用的植物種類有限，且遺傳穩(wěn)定性差，易于發(fā)生基因沉默[18-19]；雄性不育法雖阻斷了外源基因從花粉的逃逸[20]，但種子中仍含有外源基因;終止子法雖解決了轉基因植物外源基因通過種子傳播的問題，但存在種子敗育的問題，不能用于播種，迫使種植者高價購買種子，造成嚴重的經濟損失[21]。因此，這些技術的自身局限性使得其不能從根本上解決轉基因植株帶來的安全性問題。而由Luo等[22]提出的外源基因刪除系統(tǒng)，具有徹底、特異、高效清除的特點，被認為是解決轉基因植株外源基因逃逸問題的最有效方法。其利用器官發(fā)育特異啟動子與識別特異酶切位點的重組酶基因結合，將特異性器官中的外源基因刪除，而其他器官由于沒有啟動這一套刪除系統(tǒng)依然保留所有的轉入基因，繼續(xù)發(fā)揮轉入基因帶來的優(yōu)良性狀。目前對于外源基因刪除系統(tǒng)的研究大多集中于草本植物[23]，對于木本植物研究較少，且轉化率較低[24-26]。因此在木本植物中研究外源基因刪除系統(tǒng)的轉化并提高其轉化率，對于其在樹木上的應用及后期性狀表達的檢測具有重要意義，為解決轉基因樹木外源基因逃逸問題奠定基礎。

本實驗以白楊353無性系為材料，采用農桿菌介導法將pAB5啟動子誘導的外源基因刪除系統(tǒng)轉入其中，通過正交試驗設計對遺傳轉化體系中的菌液OD600值、侵染時間、AS濃度、分化培養(yǎng)基中卡那霉素 (Kan) 和頭孢霉素 (Cef) 濃度，進行試驗，旨在得出轉化率較高的優(yōu)化體系，同時研究生根篩選時Kan和Cef濃度對抗性芽生根的影響，為快速評價楊樹轉化外源基因刪除系統(tǒng)的有效性研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1植株材料

將雜種白楊353無性系無菌苗培養(yǎng)于 (25 ± 2) ℃，光照為16 h/d條件下的組培室中，無菌苗繼代和擴繁后得到的葉片作為遺傳轉化受體材料。

1.1.2菌株與載體

本研究所用農桿菌菌株為GV3100，植物表達載體為pBIN19。外源基因刪除系統(tǒng)載體結構如圖1。

圖1 pAB5誘導的外源基因刪除系統(tǒng)Fig.1 The GM-gene deletor system induced by the pAB5 promoter

1.2 實驗方法

1.2.1侵 染

在無菌條件下取生長良好的無菌苗第1～3片葉片，剪成0.5 cm × 1.0 cm的葉盤，近軸端向下放在不定芽誘導培養(yǎng)基 (MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 0.01 mg/L TDZ) 中預培養(yǎng)3 d后，浸入菌液OD600值為0.6～1.2的菌液中侵染6～12 min并輕輕振蕩；取出葉盤，用無菌濾紙吸干；將葉盤轉入含有100～400 mol/L AS的不定芽誘導培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)；3 d后放在20～35 mg/L Kan和300～450 mg/L Cef的培養(yǎng)基上篩選3～4周，每10 d換1次培養(yǎng)基；抗性芽高于1.5 cm時，將抗性芽轉入篩選生根培養(yǎng)基 (1/2 MS + 0.2 mg/L IBA + 0.2 mg/L NAA) 中培養(yǎng)，生根篩選培養(yǎng)基中Kan濃度為20、25 mg/L，Cef濃度為200 mg/L。

以上培養(yǎng)基中添加3%蔗糖，5 g/L瓊脂，pH調至5.8；侵染后葉盤在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照為16 h/d，溫度 (25 ± 2) ℃。

1.2.2GUS染色檢測

取篩選生根抗性353無性系的葉片，放入2 mL離心管中進行染色。采用Gallagher[27]方法進行GUS組織化學染色。用95%乙醇洗去葉片表面的浮色，以未轉化的353無性系葉片作為對照。

1.2.3轉基因植株PCR檢測

用優(yōu)化體系得到的抗性生根植株進行PCR分子檢測，采用CTAB法提取353無性系葉片基因組DNA，以質粒為陽性對照，以未經轉化的353無性系基因組DNA為陰性對照。GUS基因特異性引物5′-GCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGG-3′,5′-CAGGAGCAAGGTGAGATGACAGG AGAT-3′,PCR

PCR反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖電泳檢測。

1.3 實驗設計

1.3.1正交實驗優(yōu)化

以OD600值、侵染時間、共培養(yǎng)基中AS濃度、分化培養(yǎng)基中Kan和Cef的濃度為因素，每個因素設4個水平，采用L16(45) 正交設計 (表1) 優(yōu)化農桿菌介導的353無性系遺傳轉化體系。共16個處理，每個處理檢測30個葉盤，重復3次。培養(yǎng)30 d后，按公式 (1) 計算再生抗性芽的葉盤數(shù)，采用Kan抗性芽葉盤數(shù)的百分率作為評價轉化效果的指標。極差值R=(k(最大值)-k(最小值))，Kx表示在Tx條件下獲得的葉盤分化率的總和，kx表示在Tx條件下葉盤分化率的平均值。

1.3.2生根培養(yǎng)基抗生素濃度的優(yōu)化設計

將得到的353無性系抗性芽放入分別含有20 mg/L Kan、200 mg/L Cef和25 mg/L Kan、200 mg/L Cef的生根培養(yǎng)基中，15 d后觀察抗性芽在不同濃度Kan和Cef組合的生根情況，并統(tǒng)計生根率，每次試驗隨機選取抗性芽30個，重復3次，按公式 (2) 計算生根率。

表1 正交實驗設計Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.4 數(shù)據分析

采用Excel 2010和SPSS 17對數(shù)據進行進行方差和極差的分析，Duncan檢驗分析樣本間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 葉盤分化率優(yōu)化的結果分析

葉盤分化30 d后觀察其分化狀況，在16個處理中，T6分化芽最多，且長勢比較健壯，其次是T5、T7、T2，而其他處理還未見分化 (圖2)。其中T5、T6、T7中菌液OD600值均為0.8，T2菌液OD600值為0.6，表明菌液OD600值對抗性芽的產生有較大的影響。T1～T16獲得的葉盤分化率分別為0、20%、6.67%、0、60%、66.67%、56.67%、6.67%、20%、3.33%、13.33%、6.67%、3.33%、0、0、0。

由表2可知，葉盤分化率為0～66.67%。353無性系遺傳優(yōu)化體系為預培養(yǎng)3 d，菌液OD600值0.8，侵染時間8 min， AS濃度200 μmol/L，共培養(yǎng)時間3 d，篩選培養(yǎng)基中加入35 mg/L Kan，350 mg/L Cef。轉化率隨著菌液OD600值增加表現(xiàn)為先增加后降低，在菌液OD600值為0.8時，葉盤分化率達到最大；隨著侵染時間的增加，也顯示出先增加后降低的趨勢，當侵染時間為8 min時，遺傳轉化效果最佳；隨AS的濃度改變，轉化率整體趨勢也為先增后減，在200 μmol/L時獲得轉化率最高；隨著Kan濃度的增加轉化率整體趨勢是隨著提高，在最高濃度35 mg/L時獲得轉化率最高；隨著Cef濃度的增加，轉化率先提高后降低，在濃度為350 mg/L時，轉化率最高。

圖2 30 d時葉盤分化狀況Fig.2 Leaf disc differentiation at 30 days

表2 L16(45) 正交表設計及極差分析Table 2 L16(45) orthogonal tests and range analysis

在極差分析中，極差R值的大小反應了每個因素對于試驗的影響程度，R值越大，說明該因素對于試驗結果影響越明顯。從表3的極差計算結果可以看出，5個因素的R值為菌液OD600值 > 篩選培養(yǎng)基中Cef的濃度 > 侵染時間 > 共培養(yǎng)基中AS濃度 > 篩選培養(yǎng)基中Kan的濃度，因此對于試驗結果的影響從大到小排列為菌液OD600值、篩選培養(yǎng)基中Cef的濃度、侵染時間、共培養(yǎng)基中AS濃度、篩選培養(yǎng)基中Kan的濃度。

極差分析不能估計試驗誤差，因此無法分析試驗的精度。為了判斷5個因素對于試驗結果的影響是否顯著，本研究對試驗結果進行了方差分析，結果見表3。由表3可知，這5個因素對試驗結果的影響都達到顯著水平，其中F值大小順序為菌液OD600值 > 篩選培養(yǎng)基中Cef的濃度 > 共培養(yǎng)基中AS濃度 > 篩選培養(yǎng)基中Kan的濃度 > 侵染時間，表明獲得的葉盤分化率的差異在用4種不同菌液OD600值時差異最大，其次是在篩選培養(yǎng)基中4種Cef濃度之間的差異，共培養(yǎng)基中4種不同AS濃度獲得的抗性芽葉盤率差異相對減少，利用篩選培養(yǎng)基中4種不同Kan濃度獲得的葉盤分化率差異更小，用4種不同侵染時間獲得的轉化率差異最小。

表3 正交試驗各因素方差分析Table 3 Variance analysis for each factor of orthogonal tests

采用優(yōu)化后的轉化體系，預培養(yǎng)3 d，OD600值0.8，侵染時間8 min，AS濃度200 μmol/L，共培養(yǎng)時間3 d，篩選培養(yǎng)基中加入35 mg/L Kan，350 mg/L Cef，轉化353無性系，得到分化芽，并統(tǒng)計獲得葉盤分化率為80.00%?？剐匝扛叨葹?.5～2 cm時，接種到生根培養(yǎng)基中進行生根篩選。

2.2 生根優(yōu)化的結果分析

由圖3可知，在25 mg/L Kan，200 mg/L Cef中根的生長比較緩慢且側根少，生根率達到53.33%，在20 mg/L Kan，200 mg/L Cef中根生長健壯且側根比較多根生長，生根率達到73.33%。對未生根的抗性芽進行GUS染色和PCR檢測，GUS未變藍色且PCR無條帶，說明未生根抗性芽為假陽性抗生素濃度的增加使假陽性抗性芽的數(shù)量減少，后期只需對生根的抗性芽進行檢測。抗性芽在含有25 mg/L Kan的生根培養(yǎng)基中生根緩慢，但楊樹的生長狀況與未轉基因植株的沒有差異，與添加20 mg/L的Kan的篩選作用相比，其明顯減少了后期的GUS染色和PCR檢測的工作量，因此利用25 mg/L Kan對于轉基因植株的篩選效果更好。

a. 25 mg/L Kan、200 mg/L Cef生根培養(yǎng)基中抗性芽生根狀況；b. 20 mg/L Kan、200 mg/L Cef生根培養(yǎng)基中抗性芽生根狀況。

在25 mg/L Kan和200 mg/L Cef的生根篩選培養(yǎng)基中，隨機選取20株生根植株的葉片進行GUS染色，獲得8株植株葉片呈藍色，未轉化植株葉片未變藍，其中1～6為GUS陽性植株葉片，7為未轉化植株葉片 (圖4)。初步證明7株植株為陽性植株。

1～6. GUS 陽性 ‘353無性系’；7. 未轉基因 ‘353無性系’。

2.4 轉基因353無性系的PCR檢測

對抗性植株葉片進行PCR擴增，分別以陽性質粒和未轉化的353無性系作為陽性對照和陰性對照，結果見圖5。共檢測到具有特異性條帶的陽性植株7株，未轉化植株無條帶， M為Marker2000，1～7為轉基因植株，8為質粒，9為未轉化植株，證明pAB5啟動子誘導的刪除系統(tǒng)已經整合到353無性系基因中。

M. Maker 2000; 1～7；轉基因植株；8. 質粒；9.未轉基因植株。

3 結論與討論

高效轉化體系是獲得大量轉基因植株的前提。合適的菌液OD600值是獲得抗性芽的前提，后期的抑菌抗生素濃度是葉盤正常分化的必要條件，侵染時間和菌液OD600值的相互協(xié)調作用是獲得抗性芽同時又能在后期抑制菌生長的保證，AS濃度的適宜提高葉盤分化抗性芽的數(shù)量，Kan濃度的確定是篩選抗性芽、減少后期檢測工作量的前提。每個因素對于葉盤轉化率的提高都是必不可少的。本研究通過正交實驗設計建立了白楊轉化優(yōu)化體系，利用優(yōu)化體系進行353無性系的分化，得到葉盤分化率為80.00%，生根篩選時生根率達到53.33%，這比賈小明等[28]以白楊353轉化FT1基因獲得29.84%卡那霉素抗性植株再生率明顯提高；PCR檢測后得到7株陽性植株，而賈婕等[17]以白楊353和717為材料僅獲得2株陽性植株。

轉化率的提高可能與菌液OD600值及侵染時間有關。在轉化雜交楊 (山楊 × 新疆楊) (P.davidia-

na×P.bollena) 時，菌液OD600值為0.8，侵染時間為20 min時轉化率最高，增加或者降低菌液OD600值轉化率均降低，延長或縮短侵染時間也使轉化率降低[8]。以南林895楊 (P.deltoides×P.euramer-

icana) 為材料的遺傳轉化體系中發(fā)現(xiàn)：當菌液OD600值為0.7，侵染時間為120 min時轉化效率最高，增加或者降低菌液OD600值均降低了轉化率[9]。主要因為農桿菌菌液OD600值和侵染時間直接影響T-DNA向植物細胞的轉移率，菌液OD600值過大或侵染時間過長會使外植體褐化，菌液OD600值過小或侵染時間過短使農桿菌吸附到外植體表面的菌液過少從而降低了轉化率[29]。本研究中優(yōu)化轉化體系中菌液OD600值為0.8，侵染時間為8 min時葉盤分化率最高，與賈小明等[28]中的菌液OD600值為0.5，侵染時間為60 min相比，菌液OD600值增加而侵染時間降低，而王斌[24]的侵染時間僅為5 min，說明在一定范圍內增加侵染時間會增加轉化率，時間過長則降低了轉化率。

AS濃度也可對轉化率產生影響。AS是農桿菌轉化楊樹中常用的有效Vir基因誘導物，其活化了Vir區(qū)基因從而增加了T-DNA的轉移。在以雜交楊NC5331 (P.nigravar.betulifolia×P.trichocarpa) 為材料的遺傳轉化中，加入AS可使轉化率增加，且在25 μmol/L時轉化率最高[30]。農桿菌轉化雜交山楊pcg (P.canescens×P.grandidentata) 時，在菌液和分化培養(yǎng)基中添加AS能提高抗性芽葉盤的百分率，且隨著AS濃度的增加抗性芽葉盤的百分率升高[31]。本研究中AS濃度為200 μmol/L時葉盤分化率最高，這與Confalonieri等[32]的研究結果一致。

培養(yǎng)基中抗生素種類及濃度也會影響轉化率?？股啬苡行У囊种?、殺死細菌，防止其影響植株的再生和正常生長，在農桿菌介導的楊樹轉基因實驗中，Kan多作為農桿菌轉化植株的選擇抗生素[33]。Kan雖能篩選轉基因細胞，但濃度過大時會抑制愈傷組織和分化芽的形成，濃度過小則會產生假抗性芽和嵌合體[31-32,34-35]。同時，分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基所用的Kan濃度不同，通常生根培養(yǎng)基中的濃度會低于分化培養(yǎng)中的濃度[36-37]。本實驗分化培養(yǎng)基中的Kan濃度為35 mg/L時葉盤分化率最大，生根培養(yǎng)基中的Kan為25 mg/L。同時，抑菌抗生素在農桿菌遺傳轉化中能有效抑制農桿菌繁殖，但也對植物細胞具有傷害作用[33]，因此適合的抑菌抗生素濃度對于提高轉化率非常必要。農桿菌介導的楊樹轉基因中因菌株不同，抑菌抗生素也不同。本實驗選擇Cef為抑菌抗生素，其濃度為350 mg/L時，抗性芽葉盤的百分率最高，而生根培養(yǎng)基中選擇200 mg/L Cef為篩選濃度。Kan的作用是篩選抗性芽，但具有抑制葉盤分化的作用，本實驗中得到的優(yōu)化體系Kan濃度為最大濃度，以后的實驗可以通過增加其濃度探索得到葉盤分化率更高且對葉盤分化抑制作用較小的濃度。

生根時進行篩選的作用是抑制或者殺死非轉化不定芽，避免產生大量的非轉化植株，從而減少后期檢測的工作量[38]。本研究中抗性芽在含有25 mg/L Kan、200 mg/L Cef生根培養(yǎng)基中生根率達到53.33%，且更具有篩選作用。但在龍萃等[33]的研究中用了50 mg/L Kan作為生根篩選的最終濃度，筆者仍然需要進行進一步的實驗和研究。

致謝：感謝美國康涅迪格大學的李義教授為本實驗提供的雜交353楊和pBIN19載體。