羅文濤 何啟蓋 陳芳洲 李 靜 周杰瓏

(1. 西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2. 華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；3. 華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070)

豬腹瀉病對我國乃至全球生豬產業(yè)危害巨大[1]，造成豬群腹瀉的病原主要是病毒，其次是細菌和寄生蟲等[2]。豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)、豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)、豬A群輪狀病毒 (PoARV)、豬C群輪狀病毒 (PoCRV)、豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2) 是常見的病毒性腹瀉病原[3-4]。針對病毒性病原的常規(guī)檢測方法包括：病毒分離鑒定、常規(guī)PCR、熒光定量PCR、中和試驗、間接免疫熒光 (IFA)、ELISA等方法，但是以上方法都建立在已獲得病毒基因序列和相應抗體的基礎上，無法檢測未知的病毒。

下一代測序技術 (NGS) 又稱第2代測序或高通量測序，是新世紀開始發(fā)展起來的新測序技術，在2007年NGS被 《Nature Methods》 評選為生物領域影響力最大的突破性技術[5]。NGS的發(fā)展為生物學領域的研究提供了新的思路，在微生物、植物、人類疾病方面都得到了廣泛應用，近幾年在獸醫(yī)領域也愈發(fā)受到重視，開始在與動物疾病相關的病原學、基因組學、流行病學等領域得到應用?；贜GS發(fā)展起來的病毒宏基因組學實現了對海洋、污水、淡水湖[6-7]及蝙蝠、火雞、豬等動物的組織、糞便、血液[8-10]中病毒群落的宏基因組學分析。該技術具有高通量、高精度、高效率等1代測序不可比擬的優(yōu)勢，可以一次性檢測出環(huán)境(有機環(huán)境和無機環(huán)境)中的所有病毒核酸，有助于同時檢測多種豬群疾病和發(fā)現新的病原。本研究通過采集四川省某反復暴發(fā)腹瀉豬場的仔豬腸道樣品，進行NGS測序分析，再利用常規(guī)PCR方法對NGS結果進行驗證，找到引發(fā)該豬場腹瀉問題的病毒，為相關豬場后期免疫方式及程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016年10月于四川省某反復出現2～4日齡仔豬腹瀉的豬場采集了9份發(fā)病仔豬全部腸道組織，所有腸道組織混合勻漿，反復凍融3次，進行NGS樣品處理。

1.2 主要試劑

DNase I、RNase A、DNTPs、Recombinant RNase Inhibitor、M-MLV RTase、Klenow fragment購自大連寶生物公司 (TaKaRa)。Phi29DNA polymeras購自北京NEB公司。DNAeasy Blood & Tissue Kit、RNeasy Mini Kit購自德國QIAGEN公司。AxyPrep Plasmind Minirep Kit、AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自Axygen (杭州) 公司。2 × Master Mix購自TIANGEN公司。

1.3 引物設計

隨機引物及特異性引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，PEDV檢測引物根據其M基因[11]設計，F: TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG, R: CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC，產物668 bp；PEDV測序引物根據其S基因設計，F: TTGAAGAATGGTAAGTTGC, R: GCACTAGTAACATTAAG，產物708 bp；PCV3的檢測引物為：F: ATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTG, R: TAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTC，產物374 bp。

1.4 儀器設備

PCR儀由美國Bio-Rad公司制造；恒溫水浴鍋由富華儀器有限公司制造；超凈工作臺由北京東聯哈爾儀器有限公司制造；常溫或冷凍離心機由德國Eppendorf公司制造；-80 ℃超低溫冰箱由Thermo公司制造；Nanodrop 2000分光光度計由Thermo公司制造；瓊脂糖凝膠電泳儀由北京六一儀器廠制造。

1.5 實驗方法

1.5.1NGS測序樣品制備

將組織勻漿液12 000 r/min離心5 min后，上清液經0.45 μm、0.22 μm的濾器過濾除菌，備用；取濾液130 μL加入15 μL 10 × DNase I buffer、4 μL DNase I、1 μL RNase A，共計150 μL體系，37 ℃持續(xù)1 h進行外源核酸消化；消化完畢，應用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit病毒基因組提取試劑盒提取豬糞便中病毒群落的DNA；應用 QIAGEN RNeasy Mini Kit病毒基因組提取試劑盒提取豬糞便中病毒群落的RNA，取13 μL RNA，加入1 μL隨機引物、0.5 μL M-MLV RTase、1 μL dNTPs，42 ℃金屬浴1 h；75 ℃滅活M-MLV RTase活性10 min，反轉錄成sscDNA；sscDNA使用Klenow fragment在37 ℃反應1 h，合成dscDNA；將提取的DNA及dscDNA進行單引物擴增 (SISPA)，產物經純化、濃縮后送至南京諾禾致源生物科技有限公司進行宏基因組建庫測序。

1.5.2常規(guī)PCR檢測

針對NGS分析得到的病毒信息，使用常規(guī)引物進行特異性檢測，引物序列見1.3。PEDV-M反應條件為：94 ℃，5 min →(94 ℃, 50 s → 55 ℃, 1 min → 72 ℃, 1 min)35個循環(huán) → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。PEDV-S反應條件為：94 ℃, 4 min →(94 ℃, 30 s → 56 ℃, 30 s → 72 ℃, 45 s) 35個循環(huán) → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。PCV3反應條件為：94 ℃, 5 min →(94 ℃, 30 s → 56 ℃, 30 s → 72 ℃, 40 s) 35個循環(huán) → 72 ℃, 10 min → 16 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 NGS檢測結果

樣品中共獲得1 388 488條reads，其中997 082條注釋到細菌 (Bacteria)，占比72%；53 805條注釋到古細菌 (Archaea)，占比4%； 334 584條注釋到病毒，占比24%。在病毒reads中Caudovirales占比達94%，主要是為噬箘體目的一些序列，見圖1a；豬流行性腹瀉病毒 (PEDV) reads為2 352條，占病毒reads的0.7%，占整個樣品的0.2%，見圖1b。

在樣品中還存在1%的reads屬于Circoviridae SFBeef，其占到了病毒reads的5%，通過查看該reads的解釋可知這是屬于環(huán)病毒科 (Circoviridae) 的一種新型病毒，其reads經拼接后可知該新型環(huán)狀病毒即為豬圓環(huán)病毒3型 (PCV3) (圖1c)。

2.2 病毒PCR特異性檢測與分析

2.2.1PEDV驗證與分析

根據NGS分析得到的結果，合成常規(guī)引物對PEDV進行常規(guī)檢測，得到的結果如圖2a所示，可以看到出現約668 bp的目的條帶，常規(guī)檢測與NGS檢測結果一致。對該PEDV陽性病料擴增PEDV S1基因，得到結果如圖2b，將擴增產物送至武漢擎科生物科技有限公司測序，依據S1基因測序結果構建系統(tǒng)進化樹如圖3。從系統(tǒng)進化樹中可以看到該樣品中的PEDV與該豬場此前送檢的PEDV為相同毒株，且該場PEDV毒株為獨立的1個分支，可能為一新型變異毒株，這也揭示了為什么疫苗無法完全控制該場腹瀉反復暴發(fā)的原因。

圖2 樣品S中PEDV M基因與S基因擴增結果Fig.2 The detection result of PEDV M gene and S gene

●：該樣品來源豬場此前所測得的序列；▲：本樣品中測得的序列。

2.2.2PCV3驗證與分析

根據PCV3 ORF2基因設計特異性引物，進行常規(guī)PCR檢測，凝膠電泳結果如圖4。

由圖4可知，NGS檢測結果與特異性PCR檢測結果一致，且擴增產物測序結果說明樣品中確定存在PCV3。本研究利用PCV3的reads成果拼接出該病毒的一條全基因組，據該全基因組構建的系統(tǒng)進化樹如圖5。在親緣關系上與韓國KU-1506 (NCBI登錄號：KY996345.1) 最為接近。

圖4 PCV3擴增后電泳圖Fig.4 Electrophoresis analysis of PCV3

▲為本研究獲得的毒株。

3 結論與討論

在臨床樣品的病毒reads中噬菌體 (Phage) 占比94%，噬箘體在1915年在英國被發(fā)現[12]，1917年被命名為噬箘體，即為吞噬細菌之意[13]，噬箘體是一種細菌病毒，具有殺死細菌的功能[14]，在調節(jié)菌群結構和功能中發(fā)揮著巨大作用[15]。樣品中的噬菌體占比較大，這是因為腹瀉樣品主要為仔豬腸道，腸道中存在大量細菌，相應的也存在大量噬菌體，噬菌體與宿主之間并不是完全的捕食性關系，大多維持平衡的共生狀態(tài)，根據環(huán)境決定是否發(fā)生裂解-溶原經過[16]。

PEDV屬于尼多病毒目 (Nidovirales)，冠狀病毒科 (Coronaviridae)，冠狀病毒屬 (Alphacoronavirus) 的一種單鏈RNA病毒[17]。PEDV可引起豬流行性腹瀉 (PED)，PED主要導致一周齡內的仔豬腹瀉，同時伴隨嘔吐、厭食、脫水和體重減輕。PEDV的 病理變化主要是導致豬空腸和回腸的腸絨毛萎縮和脫落[18]。PEDV自2010年來先后在廣東、河南、武漢、四川等地被檢測到[19]。成為近十年我國仔豬腹瀉的主要病原。本研究中發(fā)現豬群感染PEDV導致的腹瀉，并且進化樹分析發(fā)現該場PEDV屬于獨立的一個分支，所以該場注射的疫苗后防控效果不佳。

PCV3是一種單鏈環(huán)狀DNA，全基因組具有2000個核苷酸，在復制期間單鏈轉化為雙鏈DNA，并具有3個開放閱讀框 (ORF)。ORF1是最大的開放性閱讀框，并且編碼與圓環(huán)病毒復制相關蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白，ORF3編碼的蛋白還不清楚[20-21]。Phan等于2016年通過NGS技術首先在患有心肌炎的豬群樣品中檢測到該病毒[20]，同年Palinski等也在豬皮炎與腎臟綜合征 (PDNS) 樣品豬檢測到PCV3[21]。于2016年報道了國內首例PCV3[22]，隨即韓國及波蘭均有在豬群中檢測出PCV3的報道[23-25]。研究顯示在肺臟、腦、淋巴結、扁桃體、血清等樣品中均可檢出PCV3，陽性豬群臨床癥狀包括腹瀉、繁殖障礙、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (PMWS) 等[23]。目前PCV3的致病性還不明確，其和豬群腹瀉之間是否有直接聯系還不清楚。但是豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2) 臨床上可以引起豬群腹瀉[26]，并且具有免疫抑制的作用[27]，使得感染其他疾病的可能性增加，PCV3可能存在與其相似的致病機制。PCV3可以在腸道組織中檢出，提示其腸道致病性的可能。

通過本研究證實了NGS技術在豬群疾病檢測中應用前景巨大，同時證明臨床腹瀉仔豬腸道中存在PEDV與PCV3混合感染的情況，豐富了對于豬群腹瀉疾病病毒感染情況的認知。但是目前NGS技術用于疾病檢測價格相對較高，且周期較長，在后期實現實驗室建庫自主化之后，可以大大降低時間成本和經濟成本，可在豬群復雜臨床癥狀的診斷中推廣使用。