楊鶴同 趙 楠 趙桂華

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400)

歐美楊I(lǐng)-107 (Populus×euramericana‘74/76’) 是山東省臨沂地區(qū)主栽樹種，占楊樹栽培面積的90%。歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病主要發(fā)生在春季楊樹造林地，高速公路和鄉(xiāng)間公路楊樹綠化帶栽種的1年生幼樹，發(fā)病期為4—6月，發(fā)病高峰期在4月下旬至5月上旬。2011年在山東費(fèi)縣和沂南縣的調(diào)查顯示，潰瘍病斑的數(shù)量最多可達(dá)26個(gè)/株，發(fā)病率為100%，個(gè)別造林地的死亡率可高達(dá)90%，造成很大經(jīng)濟(jì)損失。

在我國，引起楊樹潰瘍病的病原真菌有十多屬、數(shù)十種，其中擬莖點(diǎn)霉屬 (Phomopsis) 是一類重要的病原菌，主要引起楊樹 (Populus) 樹干和枝條潰瘍病，在溫帶和亞熱帶的楊樹栽培區(qū)尤為常見。擬莖點(diǎn)霉屬是一個(gè)大屬[1]，有976個(gè)種、變種和?；?，我國記載了83種[2-3]。其中在楊樹上有大孢擬莖點(diǎn)霉 (Phomopsismacrospora)[3-6]、杜仲生擬莖點(diǎn)霉 (P.eucommiicola)[7]、楊生擬莖點(diǎn)霉 (P.populina)[8]、葡萄擬莖點(diǎn)霉 (P.putator)、淡白色擬莖點(diǎn)霉 (P.pallida) 和伊特魯里亞擬莖點(diǎn)霉 (P.tirrenica)，矩園形擬莖點(diǎn)霉 (P.oblonga)[9]和Phomopsissp.[10-11]7種，都能引起楊樹潰瘍??；越桔擬莖點(diǎn)霉 (P.vaccinii) 最早報(bào)道的寄主是越桔屬植物，也能引起藍(lán)莓 (Vacciniumuliginosum) 的枝枯病[12]。有性世代為子囊菌亞門的間座殼屬 (Diaporthe)，在自然界罕見。

引起楊樹潰瘍病的病原菌有多種，癥狀和病癥各異，同種病原真菌在不同的寄主上表現(xiàn)癥狀有差異，不同病原菌在相同寄主上可出現(xiàn)相同癥狀；有些楊樹潰瘍病有復(fù)合侵染和潛伏侵染現(xiàn)象，但只有1種病原菌是主要病原。為研究歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病，本研究對病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化，形態(tài)測量、描述，DNA分子測序和致病性試驗(yàn)，確定病原種類，為病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

2010年5月—2012年9月，分別在山東省臨沂市沂南縣、沂水縣、蒙陰縣、費(fèi)縣、莒南縣、蘭山區(qū)和羅莊區(qū)對歐美楊I(lǐng)-107是否發(fā)病進(jìn)行7次隨機(jī)調(diào)查，對1年生發(fā)病較重的造林幼樹進(jìn)行重點(diǎn)調(diào)查。選擇具有典型潰瘍病癥狀的樹干或枝條，用手鋸或修枝剪采集20～25 cm長的木段，每個(gè)調(diào)查地點(diǎn)采集5～10段，帶回實(shí)驗(yàn)室后放在冷藏箱內(nèi) ((4 ± 1) ℃) 進(jìn)行保存，供分離培養(yǎng)使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1病原菌分離培養(yǎng)與純化

將標(biāo)本病斑表面用70%酒精棉球消毒3次，待干燥后用滅菌后的解剖刀去掉表面樹皮，挖取病健交界處的組織 (約3 mm × 3 mm的小塊)，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，5～6塊/皿，共分離50～55皿；將培養(yǎng)皿放在PRX-250A型智能人工氣候箱 ((25 ± 1) ℃，相對濕度 (RH) 70%，黑暗) 內(nèi)培養(yǎng)。第5天開始觀察，記錄分離到的真菌、細(xì)菌菌落數(shù)量和形態(tài)，統(tǒng)計(jì)各種真菌的出現(xiàn)頻率，并進(jìn)行編號。用挑針挑取不同的菌落邊緣的菌絲，轉(zhuǎn)移到PDA平板上進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)管保存于4 ℃冷藏箱中待用。

1.2.2致病性實(shí)驗(yàn)

將出現(xiàn)頻率較高的菌株P(guān)H-01、PH-02和PH-03在PDA平板上培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)條件同1.2.1；用滅菌的打孔器 (直徑5 mm) 在菌落邊緣打成菌餅，以保證每一個(gè)傷口的接種量相同。

于2012年8月10日，在山東省臨沂市林科所苗圃，選擇地徑1～1.3 cm的1年生歐美楊I(lǐng)-107樹苗，分別用PH-01、PH-02和PH-03菌株進(jìn)行接種。在每棵楊樹苗的中下部，離地面約50 cm處，用滅菌的解剖刀將樹皮切成一個(gè) “T” 型傷口，深至木質(zhì)部，用解剖刀將樹皮掀開，把帶有PDA培養(yǎng)基菌餅放入 “T” 型傷口中，接種處蘸有無菌水的棉球覆蓋保濕，其上再用塑料布包扎。每種真菌接種30株，每株楊樹苗的中下部位接種1處。接種5 d后，檢查接種傷口的變化，以后每隔10 d檢查1次，記錄發(fā)病情況，共檢查3次；用無菌水脫脂棉包扎的傷口作CK。

1.2.3病原菌鑒定

1) 形態(tài)鑒定。將供試病原菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，放在 (25 ± 1) ℃的PRX-250A型智能人工氣候箱 (RH 70%，黑暗) 內(nèi)培養(yǎng)14～21 d，待產(chǎn)生成熟分生孢子后，做成臨時(shí)玻片，在德國蔡斯 (Zeiss Imagers. A1) 光學(xué)顯微鏡下測量 (n=30個(gè)) 分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)、大小，并拍照，根據(jù)相關(guān)資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)比對[13-14]。

2) DNA測序。DNA提取，PCR 擴(kuò)增和測序反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法、步驟參照文獻(xiàn) [15]，測序結(jié)果通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

調(diào)查結(jié)果表明，該病原菌主要為害1～2年生的歐美楊I(lǐng)-107楊樹造林苗主干，癥狀初期為小的、淺黃色的下陷潰瘍斑，主要分布在主干中下部，每棵樹有3～26個(gè)病斑不等，最大可達(dá)5～7 cm × 1～2 cm。在發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，2個(gè)病斑的邊緣匯合成大病斑，可達(dá)10～14 cm × 1.5～2 cm；樹皮壞死，表面干燥，黃褐色，形成許多突起、圓錐狀的小點(diǎn)，即分生孢子器 (圖1a)，在天氣潮濕時(shí)，會(huì)產(chǎn)生白色、卷須狀的分生孢子角 (圖1b)。

圖1 越桔擬莖點(diǎn)霉引起的歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病癥狀Fig.1 Symptoms of canker caused by Phomopsis vaccinii on Populus × euramericana ‘74/76’

2.2 病原菌分離

本研究對標(biāo)本進(jìn)行7次分離，共2 185塊組織。由表1可知，其中2 025塊組織長出真菌，占92.7%；細(xì)菌133塊，占6.1%；未長任何真菌和細(xì)菌37塊，占1.7%。楊樹干內(nèi)以真菌為主，細(xì)菌數(shù)量相對較少，說明楊樹潰瘍病病原菌的多樣性。通過2年不同時(shí)間對潰瘍病組織分離結(jié)果可以看出，真菌數(shù)量占90%以上，說明楊樹體內(nèi)存在大量真菌菌株；其中，在5月的3次分離得率穩(wěn)定在92%～93%，6月的2次分離得率在90%左右，7月份的2次分離得率為93.4%～97%，說明7月份的真菌菌株相對較多。細(xì)菌以6月下旬?dāng)?shù)量最多可達(dá)8.2%，7月下旬的分離得率僅為2.4%。

由表2可知，2 025個(gè)真菌菌落隸屬于9個(gè)屬，其中越桔擬莖點(diǎn)霉1 378塊，占68%，聚生小穴殼355塊，占17.5%，鐮刀菌73塊，占3.6%，其他真菌的出現(xiàn)率都在3%以下。在這些真菌中，越桔擬莖點(diǎn)霉 (Phomopsisvaccinii) 和聚生小穴殼 (Dothiorellagregaria) 被分離到的頻率最高，85.5%，它們是楊樹和其他樹木上的潰瘍病菌，接種試驗(yàn)也證明，前者的致病性高于后者；鐮刀菌 (Fusariumsp.)、頂孢霉 (Acremoniumsp.)、可可球二孢 (Lasiodiplodiatheobromae) 也能引起樹木枝干病害，但對楊樹的致病性較弱，而交鏈孢 (Alternariasp.)、黑孢菌 (Nigrosporasp.)、彎孢菌 (Curvuriasp.) 常引起葉部病害，本次未作接種試驗(yàn)；青霉 (Penicilliumsp.) 是楊樹中的內(nèi)生菌。

表1 歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病斑分離結(jié)果Table 1 Isolation results of Populus × euramericana ‘74/76’ canker

表2 歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病斑中的真菌種類Table 2 Fungal species of Populus × euramericana ‘74/76’ canker

2.3 病原菌鑒定

2.3.1形態(tài)鑒定

形態(tài)鑒定結(jié)果為越桔擬莖點(diǎn)霉PhomopsisvacciniiShear, United States Department of Agriculture Technical Bulletin 258: 7-8 (1931)[1,16]。由圖2可知，菌落初為白色，漸變?yōu)榛尹S色至灰褐色 (圖2a)，日生長量為0.7 cm。5 d開始產(chǎn)生黑色子實(shí)體，10 d以后會(huì)產(chǎn)生乳白色至灰白色的分生孢子堆(圖2b)。分生孢子座為真子座，在PDA上表生或半埋生，黑色，球形或不規(guī)則形，單腔室 (圖2c)，0.2 mm × 0.5 mm；分生孢子座壁厚，由10層以上細(xì)胞組成，外壁褐色至黑色；在表面有疏松菌絲，單孔口，圓形。分生孢子梗紡錘形或圓柱形，15～25 μm × 1.2～1.7 μm，大多為1～2個(gè)分隔，少數(shù)3個(gè)分隔，有分枝 (圖2d)，長在腔室的內(nèi)壁上；產(chǎn)孢細(xì)胞內(nèi)生芽殖型、瓶梗狀，10～15 μm × 1～1.5 μm。分生孢子有兩種類型，α型分生孢子單細(xì)胞、無色，紡錘形，具2個(gè)油滴 (圖2e)，大小為6.9～10.8 μm × 2.1～3.3 μm，平均8.1 μm × 2.8 μm；β型分生孢子無色、絲狀，直或彎曲，無分隔，大小為17.3～24.2 μm × 1.3～1.8 μm，平均20.3 μm × 1.3 μm (圖2f)。上述測量形態(tài)特征與相關(guān)資料記載的越桔擬莖點(diǎn)霉相符[14]。

雖然越桔擬莖點(diǎn)霉分生孢子座大小[16]與葡萄擬莖點(diǎn)霉相似，但β分生孢子比葡萄擬莖點(diǎn)霉小11 μm，差異較大；與淡白色擬莖點(diǎn)霉的β分生孢子相似，而分生孢子梗較短[17]。

2.3.2分子鑒定

通過對越桔擬莖點(diǎn)霉菌絲的DNA提取，用ITS1和ITS4通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為538 bp的特異性DNA片段。擴(kuò)增ITS區(qū)全序列電泳圖，如圖3。對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，用NCBI的Blast在Genbank中搜尋相似序列，其結(jié)果與Genbank中登陸號為EU520050的DNA測序結(jié)果相同，再通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性比對顯示，與Genbank中登陸號為EU520050菌株的18S核糖體RNA基因的部分序列相似；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1，5.8S核糖體RNA基因全序列，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2全序列和28S核糖體RNA基因部分序列的同源性為99%。因此，確定引起歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病菌為越桔擬莖點(diǎn)霉菌。

a. 初期白色菌落；b. 黑色子座、分生孢子器和淡黃色的分生孢子堆；c. 分生孢子器；d. 分生孢子梗；e～f. α型和β型分生孢子。

圖3 ITS 1和ITS 4區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electropherograms of PCR amplification products in ITS 1 and ITS 4 regions

2.4 致病性分析

由表3可知，在接種后的第5天，去掉包扎傷口上面的塑料布時(shí)，發(fā)現(xiàn)有9株接種PH-01的傷口已出現(xiàn)壞死 (占30%)，并伴有輕微腐爛味道；第10天有19個(gè)傷口出現(xiàn)腐爛 (占63.3%)，并向四周擴(kuò)展1～2 cm，病斑下陷明顯，水漬狀；第20天檢查全部發(fā)病，接種癥狀與自然發(fā)病癥狀基本相似，最大病斑可達(dá)5.5 cm × 1.8 cm。PH-02和PH-03的致病性較PH-01弱，接種30 d后份發(fā)病率分別為56.7%和33.3%，且PH-03的病斑擴(kuò)展很小，只限于接種傷口處。接種傷口發(fā)病時(shí)間不同，可能與3個(gè)菌株致病性和苗木生長勢有關(guān)系。第30天檢查時(shí)，CK中有1棵樹的傷口被其他真菌感染，病斑沒有向外擴(kuò)展，其他CK接種傷口長出了愈傷組織。

表3 3種楊樹真菌接種歐美楊I(lǐng)-107楊苗的致病性試驗(yàn)Table 3 Pathogenicity tests with 3 Poplius fungi inoculation on Poplius × euramericana ‘74/76’ seedlings

在接種試驗(yàn)完成后，分別對PH-01、PH-02和PH-03菌株接種后形成的潰瘍斑進(jìn)行了再分離，在接種PH-01的病斑上得到了與原來接種菌株相同的真菌，符合科赫法則。根據(jù)致病性強(qiáng)弱，確定PH-01是歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病的主要病原菌，即越桔擬莖點(diǎn)霉；PH-02和PH-03分別是聚生小穴殼和鐮刀菌，雖然這2種真菌都能致病，但比越桔擬莖點(diǎn)霉的致病性更弱，不是主要病原菌。

3 結(jié)論與討論

共分離臨沂市7個(gè)縣、區(qū)楊樹潰瘍病組織2 185塊，其中長出真菌的組織2 025塊，占92.7%，隸屬于9個(gè)屬的真菌，出現(xiàn)最多的是越桔擬莖點(diǎn)霉，占68%，其次是聚生小穴殼，占17.5%。通過形態(tài)學(xué)觀察、測量、描述、DNA測序和致病性試驗(yàn)，確定引起歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病的真菌為越桔擬莖點(diǎn)霉菌，該病原菌在我國歐美楊I(lǐng)-107上屬于首次報(bào)道，由它引起的歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病為我國楊樹新病害。

越橘擬莖點(diǎn)霉最早報(bào)道是它能引起越桔 (Vacciniumvitis-idaea) 的果腐病，并與大果越桔 (Vacciniummacrocarpon) 和藍(lán)莓的一些病害有關(guān)[18]，也是蔓越莓儲藏時(shí)期的重要病原菌[19]。Wilcox[20]用藍(lán)莓枯枝上的分離物，大果越桔枝枯病、果腐病菌孢子懸浮液或菌絲接種健康藍(lán)莓證明，在大果越桔上Phomopsissp.與藍(lán)莓枯梢病原菌是同一種真菌[1]。2005年在歐洲發(fā)現(xiàn)了越桔擬莖點(diǎn)霉，并將它列為歐洲的植物病原菌檢疫對象[21]。Farr等[22]從美國東部的高叢越桔 (Vacciniumcorymbosum) 和小紅莓 (Vacciniummacrocarpon) 枝條上分離到40個(gè)擬莖點(diǎn)霉屬菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)和ITS rDNA測序相似性，大多數(shù)菌株為越桔擬莖點(diǎn)霉。

在我國，越桔擬莖點(diǎn)霉引起歐美楊I(lǐng)-107潰瘍病發(fā)現(xiàn)于2010年，在魯東南和蘇北地區(qū)新造林地里發(fā)生普遍，導(dǎo)致造林成活率下降，造成直接經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)該引起高度警惕，查清該病原菌的來源和對楊樹造林的危害以及潛在的流行爆發(fā)趨勢。該病原菌是否也為害其他植物的研究甚少，越桔擬莖點(diǎn)霉除了為害歐美楊I(lǐng)-107和藍(lán)莓外，是否還能為害其它植物，有待證實(shí)。