劉洪劍 王曦茁 汪來(lái)發(fā) 徐六一 李成錄 曹業(yè)凡

(1. 安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031; 2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091；3. 延邊州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，吉林 延邊 133001)

馬尾松 (Pinusmassoniana) 是我國(guó)南方地區(qū)重要的荒山造林和主要用材樹(shù)種。自1982年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)病以來(lái)[1]，已擴(kuò)展蔓延到我國(guó)南方多個(gè)省份，造成我國(guó)南方地區(qū)馬尾松大量死亡，嚴(yán)重地影響我國(guó)林業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)安全。目前，在生產(chǎn)上仍缺乏有效和經(jīng)濟(jì)的防治松材線蟲(chóng)病方法。選育抗松材線蟲(chóng)病的馬尾松并應(yīng)用于林業(yè)生產(chǎn)可能是有效防治松材線蟲(chóng)病的途徑之一[2]。植物在抵抗病原物入侵的過(guò)程中，植物需要通過(guò)復(fù)雜的新陳代謝進(jìn)行自我保護(hù)，這一過(guò)程是通過(guò)各種酶催化生理反應(yīng)來(lái)完成的。過(guò)氧化氫酶 (CAT)、苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、過(guò)氧化物酶 (POD) 和多酚氧化酶 (PPO) 等是植物體內(nèi)重要的防御酶，參與植物活性氧清除及與抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，能夠抵御活性氧、氧自由基形成對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，進(jìn)而增強(qiáng)植物對(duì)病害的抵抗能力[3-4]。但不同植物在抗病反應(yīng)中酶的變化存在不同[5-6]，有關(guān)抗性馬尾松家系防御酶的研究較少。

安徽省林業(yè)科學(xué)研究院自1999年開(kāi)始對(duì)抗松材線蟲(chóng)病馬尾松家系進(jìn)行選育，并已成功選育出一些抗松材線蟲(chóng)病的家系[7-8]。本研究通過(guò)分析松材線蟲(chóng) (Bursaphelenchusxylophilus) 侵染抗性馬尾松家系后CAT、PAL、POD和PPO等防御酶活性變化規(guī)律，研究抗松材線蟲(chóng)病的生理生化機(jī)制，篩選松材線蟲(chóng)病抗性早期鑒定生理指標(biāo)，為深入了解線蟲(chóng)和寄主之間作用機(jī)制和早期抗性選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1松材線蟲(chóng)

供試松材線蟲(chóng)南馬株系來(lái)自江蘇南京 (118°46′E, 32°03′N)，寄主為馬尾松，將線蟲(chóng)接種到長(zhǎng)滿灰葡萄孢 (Botrytiscinerea) 的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)，用貝曼漏斗法[9]收集線蟲(chóng)，備用。

1.1.2植物材料

4個(gè)供試抗病馬尾松家系分別是休33-2、休15-5、廣50-4、廣59-3，均栽植在安徽省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃，栽種年份相同，生長(zhǎng)環(huán)境相似，連續(xù)4年人工接種松材線蟲(chóng)，4年接種過(guò)程中均未表現(xiàn)任何感病癥狀，具有可靠性和穩(wěn)定性。湖北省恩施馬尾松感病家系為CK。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1接種方法

選取生長(zhǎng)基本一致的抗病及感病馬尾松幼樹(shù)10株，在幼樹(shù)年生側(cè)枝莖干一側(cè)枝條采用人工皮接法接種，每株接種2 000條松材線蟲(chóng)。

1.2.2預(yù)處理

參考Lamb等[10]的方法，于接種0、6、24、72、120、168 h后采集各處理枝條，在冷凍狀態(tài)下去掉枝條韌皮部，從木質(zhì)部外圍到木心切片剪碎，放入研缽中加入少許石英砂，在冰浴上研磨成勻漿，備用。

1.2.3酶測(cè)定方法

CAT活性測(cè)定參照文獻(xiàn) [11]。以每分鐘 A240減少0.1酶量為1個(gè)酶活性單位，計(jì)算CAT活力。

PAL活性測(cè)定參照文獻(xiàn) [11]。本實(shí)驗(yàn)取預(yù)處理材料為0.5 g，在290 nm處測(cè)定吸光值，以每小時(shí)OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位，計(jì)算PAL活力。

POD活性測(cè)定參照文獻(xiàn) [12]。本實(shí)驗(yàn)取預(yù)處理材料為0.5 g，470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位，計(jì)算POD活力。

PPO活性測(cè)定參照文獻(xiàn) [13]。于525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位，計(jì)算PPO活力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPSv 7.05版本Duncan新復(fù)極差法對(duì)4種防御酶活性進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化氫酶活性變化分析

接種后各家系枝條中CAT活性變化見(jiàn)圖1。

圖1 接種后各家系枝條中CAT活性變化Fig.1 Changes in CAT activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由圖1可知，無(wú)論CK或各抗性家系在接種松材線蟲(chóng)后，CAT的活性隨著時(shí)間的推移都呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，說(shuō)明CAT在馬尾松抗松材線蟲(chóng)病中起到一定作用。枝條中CAT活性降低可能與接種松材線蟲(chóng)時(shí)在馬尾松枝條上造成傷口有關(guān)。前120 h， CK與4個(gè)抗性家系枝條中CAT活性雖有上下起伏，但差異不明顯；168 h后，CK中CAT活性沒(méi)有明顯變化，廣50-4和廣59-3枝條中CAT活性明顯上升，分別比CK升高146.8%和321.3%，說(shuō)明這2個(gè)家系對(duì)松材線蟲(chóng)具有較強(qiáng)抗性，而另2個(gè)家系枝條中CAT活性相較CK仍無(wú)明顯變化。而不同時(shí)間段、不同家系間CAT活性差異均不顯著。

2.2 苯丙氨酸解氨酶活性變化分析

接種后各家系枝條中PAL活性變化見(jiàn)圖2。

圖2 接種后各家系枝條中PAL活性變化Fig.2 Changes in PAL activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由圖2可知，在馬尾松枝條接種松材線蟲(chóng)6 h，此時(shí)組織中PAL活性達(dá)到最高值，CK和廣50-4、廣59-3、休15-5、休33-2枝條中酶活性分別為0.525、0.581、0.587、0.344、0.269 U/(g·min)，然后迅速下降，隨后各抗性家系枝條中PAL活性均有上升趨勢(shì)，到168 h后4個(gè)抗性家系廣50-4、廣59-3、休15-5、休33-2枝條中酶活性比CK分別升高200.0%、97.6%、106.4%、142.4%，且與CK的差異顯著 (P< 0.05)。PAL活性在不同時(shí)間段差異不顯著，但在不同家系間差異極顯著 (P<0.01)。

2.3 過(guò)氧化物酶活性變化分析

接種后各家系枝條中POD活性變化見(jiàn)圖3。

圖3 接種后各家系枝條中POD活性變化Fig.3 Changes in POD activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由圖3可知，各抗性馬尾松抗性家系和CK枝條中接種松材線蟲(chóng)后，枝條中POD活性出現(xiàn)上升、下降后再上升趨勢(shì)，并且在接種120 h后，各抗性家系枝條中POD活性增加趨勢(shì)明顯高于CK，168 h后，廣59-3、休15-5、休33-2枝條中POD酶活性比CK分別升高235.3%、570.6%、290.6%，說(shuō)明POD在馬尾松松材線蟲(chóng)病抗病性中起到明顯作用。POD活性在不同時(shí)間段差異不顯著，但在不同家系間差異極顯著 (P< 0.01)。

2.4 多酚氧化酶活性變化分析

接種后各家系枝條中PPO活性變化見(jiàn)圖4。

圖4 接種后各家系枝條中PPO活性變化Fig.4 Changes in PPO activity in branches after inoculation with B.xylophilus

由圖4可知，各馬尾松抗性家系和CK在枝條接種松材線蟲(chóng)后，隨著時(shí)間變化，組織中PPO都有先上升后下降然后再上升的趨勢(shì)，并且各馬尾松抗性家系枝條中PPO活性明顯高于CK。在馬尾松枝條在接種松材線蟲(chóng)120 h后降到最低值，CK和廣50-4、廣59-3、休15-5、休33-2枝條中酶活性分別為0.028、0.058、0.051、0.035、0.056 U/(g·min)，之后又逐漸上升，到168 h后分別達(dá)到0.037、0.072、0.077、0.047、0.067 U/(g·min)，各抗性家系枝條中PPO酶活性在168 h比CK升高94.6%、108.1%、27.1%、81.1%。不同時(shí)間段、不同家系間PPO活性差異均極顯著 (P< 0.01)。

3 結(jié)論與討論

松材線蟲(chóng)侵染馬尾松后，馬尾松接種松材線蟲(chóng)后有機(jī)酸活性、酚類和酶類等部分生理生化指標(biāo)發(fā)生變化[14-15]。松材線蟲(chóng)侵染松樹(shù)引起松樹(shù)發(fā)病、枯萎死亡，是系統(tǒng)性侵染病害，松材線蟲(chóng)進(jìn)入木質(zhì)部以后，在木質(zhì)部生長(zhǎng)、繁殖及移動(dòng)，引起木質(zhì)部生理發(fā)生變化，從而引起整個(gè)樹(shù)體生理的變化，包括葉子生理的變化，因此葉子和木質(zhì)部的變化有可能不一致，陳玉惠等[14]的研究證實(shí)了馬尾松幼苗接種松材線蟲(chóng)后，其莖、葉中的POD和PPO活性在病程中存在差異。本研究中，接種后木質(zhì)部防御酶的變化，可能是松樹(shù)對(duì)松材線蟲(chóng)侵染的直接生理反應(yīng)。

在正常情況下植物體內(nèi)的活性氧與其酶促清除系統(tǒng)保持著動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)受到病原真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲(chóng)侵染時(shí)，植物體內(nèi)可迅速產(chǎn)生大量活性氧。這些活性氧在植物體內(nèi)積累可對(duì)松材線蟲(chóng)產(chǎn)生毒害作用，引起植株的過(guò)敏性反應(yīng)和誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性。前120 h各家系枝條中CAT活性變化不大，差異不明顯；168 h時(shí)，CK中該酶沒(méi)有明顯變化，廣50-4和廣59-32枝條中該酶的活性明顯上升，說(shuō)明這2個(gè)家系中CAT參與了抗病反應(yīng)。與抗性植株在接種南方根結(jié)線蟲(chóng) (Meloidogyneincongnita) 后，CAT基因活性并且明顯高于感病植株是一致的[16]。另2個(gè)家系枝條中CAT活性相較CK仍無(wú)明顯變化，5個(gè)家系的CAT的變化，說(shuō)明CAT在不同馬尾松的抗線蟲(chóng)的機(jī)制是不一致的。

PAL是植保素生物合成的關(guān)鍵酶，也參與了次生抗病物質(zhì)木質(zhì)素和酚類物質(zhì)的合成與積累，被認(rèn)為是一種植物防御酶[16]。在馬尾松枝條接種松材線蟲(chóng)6 h后，此時(shí)組織中PAL活性達(dá)到最高值，后迅速下降，隨后各抗性家系枝條中PAL活性均有上升趨勢(shì)，168 h后4個(gè)抗性家系廣50-4、廣59-3、休15-5、休33-2枝條中酶活性高于CK，且差異顯著 (P< 0.05)。說(shuō)明PAL活性可能與最初的松材線蟲(chóng)抗病反應(yīng)無(wú)關(guān)，而與后期抗病反應(yīng)相關(guān)。

POD是木質(zhì)素合成中的重要酶，參與木質(zhì)素前體物質(zhì)的聚合作用，促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化及其傷口附近細(xì)胞形成木栓層，增加木質(zhì)化程度，從而增強(qiáng)植物抗病性。各抗性馬尾松抗性家系和CK枝條中接種松材線蟲(chóng)后，在接種120 h后，各抗性家系枝條中POD活性增加趨勢(shì)明顯高于CK，說(shuō)明POD在馬尾松松材線蟲(chóng)病抗病性中起到重要作用。

PPO將酚類物質(zhì)氧化成為對(duì)病原物有毒的醌類物質(zhì)，并參與木質(zhì)素合成以阻止線蟲(chóng)侵入[17]。本研究中，接種松材線蟲(chóng)后，4個(gè)抗病家系中的PPO在接種168 h前高于感病家系，不同時(shí)間段，不同家系間PPO差異均極顯著 (P< 0.01)，因此，PPO可作為馬尾松抗松材線蟲(chóng)病早期鑒定的一種有價(jià)值的重要生理指標(biāo)，同時(shí)說(shuō)明PPO可能與最初的松材線蟲(chóng)抗病反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，抗性馬尾松家系對(duì)松材線蟲(chóng)侵染后CAT、PAL、POD和PPO 活性的變化差異可能與松材線蟲(chóng)誘發(fā)松樹(shù)體內(nèi)一系列反應(yīng)，松樹(shù)感染松材線蟲(chóng)后體內(nèi)4種酶CAT、PAL、POD和PPO 活性動(dòng)態(tài)變化，在一定程度上能夠反映不同家系間的抗性差異，從而決定了其抗性機(jī)制的不同。

致謝：感謝中國(guó)林業(yè)微生物菌種中心保藏中心提供的松材線蟲(chóng)南馬株系。