黃 迪 黃 宇 翁杰鋒 黃子圣 麥振豪 張 強(qiáng) 張漢意 張 帥 古維立

肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一種多途徑、多因素參與的過(guò)程，主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的過(guò)度合成與異常沉積。肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)是參與肝纖維化形成最重要的細(xì)胞，HSCs的活化、增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1]，而抑制HSCs增殖、誘導(dǎo)其凋亡成為抗肝纖維化的重要策略。逆轉(zhuǎn)素(Reversine)作為一種人工合成的小分子嘌呤衍生物，已被證實(shí)具有誘導(dǎo)成熟細(xì)胞去分化的作用，它能夠讓高度分化的細(xì)胞回復(fù)到祖細(xì)胞狀態(tài)，而這些回復(fù)到祖細(xì)胞的狀態(tài)的細(xì)胞具有分化為不同類型細(xì)胞的潛力[2-3]。Reversine的這種促使細(xì)胞返老還童的特性的發(fā)現(xiàn)為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了一個(gè)新的思路。已證實(shí)在大鼠肝纖維化模型中，Reversine可以通過(guò)降低肝纖維化中升高的α-SMA的表達(dá)而起到抑制肝纖維化程度的效果[4]。明確Reversine對(duì)HSCs的具體影響以及相關(guān)機(jī)制對(duì)于防治肝纖維化有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光相結(jié)合的方法，在體外細(xì)胞水平探討Reversine對(duì)HSCs細(xì)胞增殖、凋亡作用以及與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，為進(jìn)一步揭示肝纖維化的發(fā)展機(jī)制及Reversine抗肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

肝星狀細(xì)胞(中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫(kù))； Reversine(Sigma公司)；cck-8試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基干粉、胎牛血清、DMSO(Sigma公司)；anti-TGF-β1(SAB4502954)、ANTI-SHC1(AB-427)(SAB4300557)、ANTI-RGN(HPA029103)(Sigma公司)；caspase-3 antibody(#9662， Cell Signaling公司)；mAb anti-Aurora B antibody(NB110-55480，Novusbio公司)；ANTI-CDKN2A/p16INK4a[2D9A12](ab54210，Abcam公司)；SMAD2/3 Antibody(BA1395，博士德生物工程有限公司)；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)(Abbkine公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)；Annexin-V-FITC/PI 凋亡試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)；生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱CCL-170A8(ESCO藝思高公司)；多功能酶標(biāo)儀(香港基因有限公司)；IX51倒置相差顯微鏡(Olympus)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSCs用體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清加1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)，細(xì)胞換液時(shí)間為1～2 d，傳代時(shí)間為3～5 d，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 以加入DMSO的HSCs作為正常對(duì)照組；加藥組：加Reversine干預(yù)，終濃度分別為5、10、20、40 μg/mL，每組藥物干預(yù)時(shí)間為24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)HSCs增殖情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升，接種于96孔板中，每孔100 μL，棄周圍一圈改加1×PBS 100 μL保持濕度，不做測(cè)量，每組做5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿后，棄掉原培養(yǎng)基，以1×PBS輕輕沖洗一遍，按照分組情況加入藥物干預(yù)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(加培養(yǎng)基100 μL)作為調(diào)零用途，24 h后加入CCK-8試劑，與培養(yǎng)基按1 ∶10的比例加入，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次。細(xì)胞抑制率計(jì)算方法：R抑制=1-(A加藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

1.2.4 FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC的凋亡 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種于3.5 cm培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿后，棄掉原培養(yǎng)基，以1×PBS輕輕沖洗一遍，按照分組情況加入藥物干預(yù)，24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞兩次，制成細(xì)胞懸液，用300目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，計(jì)數(shù)取1×105個(gè)細(xì)胞，離心后用500 μL的 Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC以及5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min， 1 h內(nèi)完成檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)TGF-β1、caspase-3、Aurora B、collagen-I、SMAD2/3、Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白的表達(dá)情況 按分組情況制成細(xì)胞爬片后，新鮮配制的4%多聚甲醛固定20 min， 0.5%Triton X-100對(duì)細(xì)胞透化處理10 min，5%BSA封閉1 h后加入一抗(用1%BSA 1∶100稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入熒光標(biāo)記的二抗(用1%BSA 1∶100稀釋)，室溫避光孵育1 h，加入0.5 μg/mL DAPI染核10 min，每做一項(xiàng)處理后都用1×PBS洗滌3次，封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 13.0軟件，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD-t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以mean±SD 表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Reversine對(duì)HSCs增殖的影響

在未加入藥物處理的情況下，HSCs增殖明顯，當(dāng)分別加入不同濃度(5、10、20、40 μg/mL)Reversine后，HSCs增殖受到抑制，其抑制率分別為38.03±9.05、44.97±5.85、55.33±2.40、64.19±3.66，F(xiàn)=27.356，P=0.000，兩兩比較p<0.05，可見(jiàn)Reversine對(duì)HSC增殖抑制呈現(xiàn)劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1。利用SPSS 13.0軟件測(cè)得Reversine在24 h對(duì)HSC的IC50值為13.45 μg/mL。

注：*表示P<0.05，***表示P=0.000圖1 不同濃度Reversine處理24 h對(duì)HSC增殖的影響

2.2 不同濃度Reversine引起HSCs凋亡

經(jīng)Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，對(duì)照組僅有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，總凋亡率為(2.36±0.61)%；而不同濃度Reversine干預(yù)HSCs 24 h后存在不同程度的凋亡(見(jiàn)圖2)。其中，Reversine濃度為5 μg/mL的總凋亡率(13.14±1.87)%與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；當(dāng)濃度上升到40 μg/mL時(shí)，總凋亡率為(21.24±1.07)%，凋亡效果更佳明顯，說(shuō)明Reversine可以誘導(dǎo)HSC凋亡，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表1。同時(shí)我們將早晚期凋亡情況分開(kāi)分析發(fā)現(xiàn)，同一濃度Reversine作用HSCs，晚期凋亡細(xì)胞要多于早期凋亡細(xì)胞。但無(wú)論是早期還是晚期凋亡，隨著Reversine濃度的增加，HSCs凋亡也隨之增加(見(jiàn)圖3)。值得注意的是，Reversine的劑量從20 μg/mL增加到40 μg/mL時(shí)，其凋亡率并沒(méi)有隨之顯著增加，兩組相比P=0.295，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其原因可能為在達(dá)到一定濃度后，Reversine使得HSCs的周期停滯在某個(gè)時(shí)期，而并不是直接引起HSCs的凋亡。

圖2 不同濃度Reversine處理24 h對(duì)HSCs凋亡的影響

組別早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)總凋亡率(%)對(duì)照組0.50±0.441.86±0.722.36±0.615 μg/mL組5.36±1.231)7.79±1.041)13.14±1.871)10 μg/mL組7.63±0.921)2)8.22±0.921)15.85±1.001)2)20 μg/mL組8.99±1.251)2)3)11.58±0.591)2)3)20.57±0.901)2)3)40 μg/mL組9.60±1.381)2)3)11.64±0.591)2)3)21.24±1.071)2)3)

注：1)表示與對(duì)照組比較，P<0.01，2)表示與5 μg/mL組比較，P<0.01，3)表示與10 μg/mL組比較，P<0.01，n=7

注：*表示與對(duì)照組比較P<0.01，#表示與5 μg/mL組比較，P<0.01，Δ表示與10 μg/mL組比較，P<0.01，n=7

圖3不同濃度Reversine處理24 h對(duì)HSCs凋亡的影響

2.3 Reversine干預(yù)HSCs后相關(guān)蛋白的表達(dá)

在熒光顯微鏡下可觀察到正常對(duì)照組HSCs的細(xì)胞核染色及大小較均一；當(dāng)用Reversine處理HSCs后，HSCs凋亡細(xì)胞逐漸增多，表現(xiàn)為細(xì)胞核大小不均、核濃縮、裂解、凋亡小體及多倍體的形成。于是，我們利用細(xì)胞免疫熒光法定性檢測(cè)了在20 μg/mL的Reversine干預(yù)HSCs后對(duì)TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3、Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白的表達(dá)的影響，見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)Reversine干預(yù)HSCs后，可以檢測(cè)到caspase-3、TGF-β1、SMAD2/3、Aurora B蛋白的熒光表達(dá)，而Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白未見(jiàn)相關(guān)熒光表達(dá)。

3 討論

肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)致肝病因子造成肝細(xì)胞損傷時(shí)，激活的Kupffer細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞及損傷的肝細(xì)胞等分泌多種細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)共同作用于HSCs，使HSCs激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，激活的HSCs通過(guò)自分泌和旁分泌，促進(jìn)HSCs增殖，合成大量ECM并在肝內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝纖維化[5]。因此，HSCs的活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，那么阻斷HSCs活化并促進(jìn)活化HSCs的凋亡對(duì)逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有實(shí)用價(jià)值。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠肝纖維化模型中，Reversine可以通過(guò)降低肝纖維化中升高的α-SMA的表達(dá)而起到抑制肝纖維化程度的效果[4]。但是，我們?nèi)圆磺宄eversine抑制肝纖維化的具體機(jī)制。鑒于HSCs對(duì)于肝纖維化的重要性，我們通過(guò)不同濃度的Reversine處理體外培養(yǎng)的HSCs，探究Reversine對(duì)HSC細(xì)胞的影響。通過(guò)CCK-8法增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在體外5 μg/mL的Reversine即可明顯抑制HSC細(xì)胞的活性，其24 h抑制率達(dá)(38.03±9.05)%，當(dāng)劑量增至40 μg/mL時(shí)，抑制率增加至(64.19±3.66)%，呈現(xiàn)一種劑量效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)計(jì)算，我們得出Reversine在24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為13.45 μg/mL。流式細(xì)胞術(shù)作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的首選方法，是目前最為理想的凋亡定量檢測(cè)方法[6]。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Reversine對(duì)HSCs早期凋亡和晚期凋亡情況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度下Reversine作用HSCs后，晚期凋亡細(xì)胞要多于早期凋亡細(xì)胞，但無(wú)論是早期還是晚期凋亡，隨著Reverssine濃度的增加，HSCs凋亡也隨之增加，且呈現(xiàn)劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系。但是值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)Reveersine的劑量從20 μg/mL增加到40 μg/mL時(shí)，其凋亡率并沒(méi)有隨之顯著增加，而是達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，究其原因可能是在達(dá)到一定濃度后，Reversine使得HSCs的細(xì)胞周期停滯在某個(gè)時(shí)期，而并不是直接引起HSCs的凋亡。

注：A表示Caspase-3；B表示TGF-β1；C表示SMAD2/3；D表示Aurora B

引起HSCs激活和凋亡的分子機(jī)制十分復(fù)雜，包括TGF-β1/Smad 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、MAPK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、PDGF 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、PPAR信號(hào)途徑、NF-κB 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞免疫熒光法定性檢測(cè)了在5 μg/mL的Reversine干預(yù)HSCs后對(duì)相關(guān)蛋白影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Reversine干預(yù)HSCs后，可以檢測(cè)到TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3蛋白的熒光表達(dá)，而Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白未見(jiàn)相關(guān)熒光表達(dá)。肝纖維化反應(yīng)的是細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解的失衡，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)合成大于降解。在肝纖維化的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分包含各種膠原蛋白，其降解過(guò)程受到金屬蛋白酶及其抑制劑(MMPs/TIMPs)的調(diào)控相關(guān)。TGF-β1既是HSC啟動(dòng)階段分子調(diào)控最強(qiáng)的促進(jìn)因子，同時(shí)也是持續(xù)激活階段的細(xì)胞因子。TGF-β1是肝臟中呈高表達(dá)的亞型，通過(guò)與Smads結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)活性，能直接和間接刺激HSC的活化和增殖。TGF-β1的表達(dá)水平與肝纖維化的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)。由此我們推測(cè)Reversine引起HSCs凋亡可能和TGF-β1/Smad介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、caspase-3蛋白途徑有關(guān)，其中具體相關(guān)蛋白的定量表達(dá)情況，本研究組將在下一步實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Reversine體外干預(yù)HSCs細(xì)胞，證實(shí)了Reversine能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并且影響肝星狀細(xì)胞TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3等蛋白質(zhì)的表達(dá)，其相關(guān)機(jī)制可能與TGF-β1/Smad 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、caspase-3蛋白途徑有關(guān)。