楊德潔，關(guān)歡歡，于秀梅，李壽如，趙偉全*，劉大群，3*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001； 2.本溪市馬鈴薯研究所，遼寧 本溪 117000； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081)

馬鈴薯是我國第四大主糧作物，在國家糧食安全戰(zhàn)略部署和農(nóng)業(yè)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變中具有重要作用[1]。我國是馬鈴薯生產(chǎn)和消費第一大國，常年種植面積在566.67萬hm2以上，總產(chǎn)量保持在9 000多萬t[2]。隨著近年來我國馬鈴薯種植規(guī)模的增長，病害對生產(chǎn)的影響日益突出。馬鈴薯瘡痂病是馬鈴薯生產(chǎn)中重要的土傳和種傳病害，感染該病的薯塊表面會形成瘡痂癥狀，降低其品質(zhì)和商業(yè)價值，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，發(fā)病薯塊不耐貯藏并且易被其他的病原菌侵染危害。在脫毒微型薯生產(chǎn)中發(fā)生瘡痂病會將病原菌帶入種薯基地，造成種薯帶菌，并隨著種薯調(diào)運(yùn)遠(yuǎn)距離傳播病害。馬鈴薯瘡痂病可由多種植物病原鏈霉菌(Plant pathogenicStreptomyces)引起，病原菌在不同地域的分布較廣，組成也比較復(fù)雜[3-4]。鑒于該病已在我國北方馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生且逐年加重[5]，而該區(qū)域亦是我國馬鈴薯種薯的主要生產(chǎn)基地，很有必要對其瘡痂病病原菌進(jìn)行跟蹤檢測。因此，本研究在2013—2017年對北方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的瘡痂病薯進(jìn)行了持續(xù)取樣，并對病原菌進(jìn)行了分離、純化與鑒定，旨在明確我國北方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)瘡痂病病原菌的組成和變化情況，為該病害的預(yù)測預(yù)報和防治研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

采集的樣本為2013—2017年我國黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、山西、陜西、山東、河北等地馬鈴薯產(chǎn)區(qū)帶有典型瘡痂病斑的病薯。

1.2 菌株的分離純化

菌株的分離與純化參照Liu等[6]的方法。使用蒸餾水清洗薯塊后，用75%乙醇擦拭薯塊表面，在獨立病斑的病健交界處切取約5 mm3的薯塊，于1% NaClO溶液中浸泡約30 s后取出，無菌水沖洗后用滅菌濾紙擦干表面水分，將其切成0.5～1 mm的薄片，置于1.5%的瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃條件下培養(yǎng)4 d，挑取目標(biāo)單菌落在OMA培養(yǎng)基上連續(xù)純化3次，得到鏈霉菌的純化菌株。

1.3 菌株致病性檢測

參照Faucher等[7]的方法進(jìn)行。選取株高約10 cm、長勢一致的馬鈴薯幼苗進(jìn)行接種。采用灌根法接種，將待測菌株孢子懸浮液濃度調(diào)整為106cfu/mL，每盆接種200 mL，并設(shè)置清水對照，每個菌株處理設(shè)5次重復(fù)。正常管理，于第11周收獲并檢測新生薯塊的發(fā)病情況，以確定菌株的致病性。

1.4 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增

按照鏈霉菌分子操作方法[8]進(jìn)行致病菌株基因組DNA提取。采用鏈霉菌16S rDNA序列通用引物Pu(5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′)和Pd(5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)對菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μL，其中2×GC bufferⅡ(大連TaKaRa公司)25 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、模板1 μL、引物各1 μL、Taq酶0.8 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.5 菌株16S rDNA序列聚類分析

將所得測試菌株的16S rDNA序列校對后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，選取同源性較高的序列，利用MEGA 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類分析。選取的參比菌株包括前期獲得的我國不同典型瘡痂病菌株CPS-1、CPS-2、CPS-3及NCBI數(shù)據(jù)庫中的S.acidiscabies(AY621376)、S.europaeiscabiei(NR_042790)、S.galilaeus(AB184378)、S.griseus(AB184347)、S.scabieiATCC49173(D63862)、S.turgidiscabies(NR_040828)、S.diastatochromogenes(NR_025867)、S.enissocaesilis(KF454847)、S.albulus(AB024440.1)、S.chartreusis(NR_041216.1)、S.galbus(NR_026178.1)、S.lividans(NZ_CP009124.1)、S.lydicus(FJ799181.1)、S.resistomycificus(EU054370.1)、S.virginiae(JN201950.1)等不同鏈霉菌模式菌株，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行聚類、鑒定。

1.6 菌株生物學(xué)特性測定

參照Lambert等[9-10]、Miyajima等[11]的方法對菌株單一碳氮源的利用情況、藥物敏感性和黑色素產(chǎn)生情況等生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與致病性檢測結(jié)果

將采集的瘡痂病薯樣品按照每個病薯選取1個病斑進(jìn)行鏈霉菌菌株分離，在每個病斑獲得的全部菌株中選取保留1個典型菌株，共分離純化出423個鏈霉菌菌株。通過溫室盆栽接種進(jìn)行柯赫氏法則驗證，將能使新生薯塊產(chǎn)生典型瘡痂病癥狀的菌株確定為致病菌株(圖1)，共篩選到141個致病性較強(qiáng)的菌株。

A：菌株Ss-1；B：菌株Sg-16；C：菌株Sd-2；D：菌株Sen-1；

2.2 菌株16S rDNA序列聚類分析結(jié)果

在致病菌株中選取42個具有不同培養(yǎng)特征的典型菌株用于16S rDNA序列分析。對提取的各菌株基因組DNA檢測結(jié)果表明，OD260/280值均在1.8～2.0，純度較好。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約1.5 kb處有明顯的目的條帶(圖2)?；厥諟y序后，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，選取最高相似度種屬的典型菌株作為系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的參比菌株，同時將不同類別的菌株進(jìn)行編號。聚類分析結(jié)果表明(圖3)，在42個測試菌株中，有17株與S.galilaeus聚為一類，8株與S.scabies或S.europaeiscabiei聚為一類，9株與S.diastatochromogenes聚為一類，3株與S.enissocaesilis聚為一類，2株與S.turgidiscabies聚為一類，1株與S.griseus聚為一類，另有2個菌株SC-8、SC-16未能有效聚類。其中S.scabies、S.europaeiscabie和S.diastatochromogene在聚類時位于同一分支，說明其親緣關(guān)系較近，尤其是S.scabies與S.europaeiscabie在親緣關(guān)系上最為接近。而S.galilaeus、S.griseus和S.enissocaesilis均為單獨分支，與以上各種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在對菌株的不同采集地區(qū)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，河北的菌株有S.scabies、S.europaeiscabie、S.diastatochromogenes、S.galilaeus、S.enissocaesilis等種，山東有S.scabies和S.turgidiscabies，內(nèi)蒙古和山西有S.scabies和S.galilaeus，陜西有S.diastatochromogenes、S.turgidiscabies、S.griseus，黑龍江有S.scabies和S.galilaeus，遼寧有S.scabies和S.griseus。說明我國北方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的瘡痂病菌種類多樣、組成復(fù)雜。

M：Marker DL2000； 1: Sg-1;

圖3 根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的致病菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株生物學(xué)特性測定結(jié)果

對典型菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性分別進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。

在所有鑒定的菌株里，除了S.enissocaesilis組和S.griseus組的菌株及SC-8、SC-16外，大部分菌株不能以木糖、果糖和阿拉伯糖為單一碳源。除了S.enissocaesilis組的菌株外，大部分菌株對鏈霉素(20 μg/mL)、苯酚(0.1%)及結(jié)晶紫(0.5 μg/mL)敏感。其中菌株Sd-1、Sen-1、Sen-2、Sen-3、Sgr-1、SC-8能以所有9種碳源和3種氮源為單一碳、氮源。測試菌株中，S.scabies組與S.diastatochromogenes組的菌株生物學(xué)特性十分相近。其中S.scabies組的菌株與典型菌株S.scabiesATCC49173的差異表現(xiàn)為不能以果糖、阿拉伯糖和木糖為單一碳源，對青霉素(10 IU/mL)不敏感。與典型菌株[12]相比，S.diastatochromogenes組的菌株不能以ISP(InternationalStreptomycesProject medium)中的果糖為單一碳源；S.enissocaesilis組的菌株能以木糖、阿拉伯糖、果糖為單一碳源；S.turgidiscabies組的菌株不能以ISP中的果糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖為單一碳源，能以組氨酸為單一氮源；S.griseus組的菌株能產(chǎn)生黑色素，能以ISP中的阿拉伯糖、鼠李糖、棉子糖、蔗糖和肌醇為單一碳源。S.galilaeus組的菌株與其他組菌株的差異性表現(xiàn)為不能以甘露醇為單一碳源，并且不能以甲硫氨酸為單一氮源。

表1 測試菌株的培養(yǎng)特征及生理生化特性

續(xù)表1 測試菌株的培養(yǎng)特征及生理生化特性

注： +.產(chǎn)生或生長；-.不產(chǎn)生或不能生長；Y.黃色；S.螺旋狀；Rf.直-柔曲狀；鏈霉素為20 μg/mL； 苯酚為0.1%；結(jié)晶紫為0.5 μg/mL；青霉素為10 IU/mL。

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯瘡痂病是典型的土傳和種傳病害，在世界各馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生，受到各國研究人員的高度重視。馬鈴薯瘡痂病可由十幾種植物病原鏈霉菌引起，不同地域的瘡痂病病原菌組成存在較大差別。美國的馬鈴薯瘡痂病菌在西部地區(qū)的優(yōu)勢種為S.europaeiscabiei，而東部地區(qū)S.scabies占優(yōu)勢[13]；韓國報道的病原除S.scabies外，還有S.puniciscabiei、S.acidiscabies、S.luridiscabiei、S.turgidiscabies和S.niveiscabiei等種[14]；法國也曾報道有S.scabies、S.stelliscabiei、S.europaeiscabiei、S.reticuliscabiei等瘡痂病菌[15]；其他如南非[16]、巴基斯坦[17]等國也有研究者在近期報道存在馬鈴薯瘡痂病菌。

隨著近年來我國馬鈴薯種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，土傳病害對馬鈴薯生產(chǎn)的影響日益突出。馬鈴薯瘡痂病已在我國各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，明確各地的瘡痂病原是當(dāng)務(wù)之急。目前已發(fā)現(xiàn)黑龍江省的致病種有S.scabies、S.europaeiscabiei、S.turgidiscabies和S.acidiscabies[18]，甘肅省有S.scabies和S.griseus[19]，新疆有S.scabies和S.acidiscabies[20]。說明我國不同地區(qū)瘡痂病原的組成差異較大。為全面了解我國北方瘡痂病病原菌的組成分布情況，本研究對2013—2017年北方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的瘡痂病菌進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定分析，發(fā)現(xiàn)存在S.scabies或S.europaeiscabiei、S.galilaeus、S.diastatochromogenes、S.turgidiscabies、S.griseus、S.enissocaesilis等種。與之前的調(diào)查結(jié)果[21]相比，本次未分離到S.bobili、S.acidiscabies和S.setonii等種，新發(fā)現(xiàn)有S.griseus存在，而S.scabies、S.galilaeus、S.enissocaesilis、S.diastatochromogenes和S.turgidiscabies等種仍穩(wěn)定存在。說明我國北方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的瘡痂病病原菌組成表現(xiàn)為穩(wěn)中有變，但整體分布依舊比較復(fù)雜，仍需對其進(jìn)行持續(xù)跟蹤監(jiān)測。

從現(xiàn)有的報道來看，在已知的瘡痂病菌中以S.scabies的分布最為廣泛，其他致病種一般為局部或多地發(fā)生。但由于馬鈴薯生產(chǎn)中調(diào)種頻繁，對瘡痂病菌的傳播影響較大，因此在進(jìn)行馬鈴薯生產(chǎn)，尤其是種薯繁育和調(diào)運(yùn)時，應(yīng)加大對瘡痂病的檢測力度，盡量減緩病原菌的傳播，并定期對不同區(qū)域的瘡痂病病原菌進(jìn)行監(jiān)測。同時積極尋求有效的病害防控途徑，以助力馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的安全持續(xù)發(fā)展。