蘆 鑫，高錦鴻，曹宇鋒，張麗霞，黃紀念*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術研究中心，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

由于花生蛋白質(zhì)資源豐富、營養(yǎng)豐富、便于加工，已經(jīng)成為世界第三大植物食用蛋白質(zhì)資源[1-3]?；ㄉ鞍踪|(zhì)雖然已經(jīng)廣泛應用于食品領域，但由于其凝膠性差，只能通過添加凝固劑(鹽、果膠)才能形成凝膠，這限制了花生蛋白質(zhì)在凝膠類食品中的應用[4-6]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶( TGase) 是一種?；D(zhuǎn)移酶，可以催化蛋白質(zhì)中的谷氨?；唾嚢彼嵩诜肿觾?nèi)及分子間形成ε-( γ-谷氨?；? -賴氨酸共價交聯(lián)[7]，增加蛋白質(zhì)尺寸，密切蛋白質(zhì)間的聯(lián)系，提高持水能力，從而改善蛋白質(zhì)的凝膠能力[8]。前人將TGase應用于花生蛋白質(zhì)改性已有諸多研究[9-11]，但大多以溶液黏度來評價改性反應進行的程度，由于TGase作用于花生蛋白質(zhì)形成大小不一的凝膠顆粒，使蛋白質(zhì)溶液呈現(xiàn)不均一的懸濁體系，測定的溶液黏度不夠準確客觀且重復性差，以此評估改性反應情況不夠合理；同時，也缺乏對TGase改性花生蛋白質(zhì)過程中蛋白質(zhì)結構組成變化的結果，因此，有必要引入新的變量來考察TGase改性花生蛋白質(zhì)過程并分析改性對花生蛋白質(zhì)結構的影響。

在TGase改性花生蛋白質(zhì)過程中，會從溶液中析出形成漂浮于液面的凝膠顆粒，將這些凝膠顆粒定義為改性蛋白質(zhì)。以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率、持水能力作為評價指標，分析酶解時間、pH值、加酶量對TGase改性花生蛋白質(zhì)的影響，確立最佳的改性條件，并分析改性過程中花生蛋白質(zhì)二級結構、亞基組成的變化規(guī)律，并對比改性前后花生蛋白質(zhì)功能特性的差異，為TGase改性花生蛋白質(zhì)的后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 花生蛋白質(zhì)粉：自制，具體條件見文獻[12]；KBr：光譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；丙烯酰胺、N，N′-亞甲雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸：電泳純，美國Amersco公司生產(chǎn)；TGase(活性4 200 U/g)：濟南青瑞生物科技有限公司生產(chǎn)；電泳Marker(分子質(zhì)量15～170 ku)：美國賽默飛世爾科技公司有限公司生產(chǎn)；其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設備 電泳儀：DYCZ-24DN，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；凝膠成像儀：Gel-Doc XR+，美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)；質(zhì)構儀：TMS-pro，美國FTC公司生產(chǎn)；傅里葉紅外分析儀：IS5，美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)；全自動凱氏定氮儀：K-05，上海晟聲自動化分析儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 TGase改性花生蛋白質(zhì) 根據(jù)前期研究[9-11]，配制質(zhì)量濃度70 g/L的花生蛋白質(zhì)溶液，在45 ℃下，分別以120、140、160 U/g的加酶量加入TGase，在pH值7.7、8.0、8.3分別反應35、45、55 min，具體見表1。反應結束后，采用配置0.075 mm孔徑濾布的平板離心機于1 000 r/min下離心，收集濾網(wǎng)上的蛋白質(zhì)凝膠團，稱取3 g凝聚團測定持水能力，剩余采用冷凍干燥，獲得改性花生蛋白質(zhì)，稱質(zhì)量計算改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率。

表1 花生蛋白質(zhì)TGase改性響應面試驗的因素與水平

1.2.2 花生蛋白質(zhì)持水能力測定 為了反映改性過程中花生蛋白質(zhì)形成凝聚團結構的均一完整程度，引入評價指標——持水能力。考察稱取0.5 g樣品，放入Amicon Ultra-4(配置截留分子質(zhì)量3 ku超濾芯)超濾離心管，稱取總質(zhì)量，4 000 r/min離心15 min,將過濾出的水倒出并擦干濾膜和離心管內(nèi)壁殘留的水珠，稱取離心后總質(zhì)量，計算持水能力[13]。

式中：WHC為持水能力，M1為樣品和離心管離心前的總質(zhì)量，M2為離心后樣品和離心管的總質(zhì)量，η為樣品中的水分含量，M為樣品的質(zhì)量。

1.2.3 改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率測定 采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010，N為5.46)測定花生蛋白質(zhì)含量(Co)與改性花生蛋白質(zhì)含量(Cf)，采用下面公式計算：

1.2.4 花生蛋白質(zhì)微觀結構分析 采用電子掃描顯微鏡分析未改性花生蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)[14]，其中，TGase改性花生蛋白質(zhì)樣品(下同)為70 g/L花生蛋白質(zhì)溶液以加酶量144.20 U/g、pH值8.15、45 ℃反應46 min的產(chǎn)物。

1.2.5 花生蛋白質(zhì)二級結構分析 參考蘆鑫等[14]的方法，獲取TGase改性花生蛋白質(zhì)樣品的紅外光譜后，用Origin 8.5以二次微分從紅外光譜1 600～1 700 cm-1的波峰中尋找隱峰，按照1 610～1 642 cm-1歸屬β-折疊、1 642～1 650 cm-1歸屬無規(guī)卷曲、1 650～1 660 cm-1歸屬α-螺旋、1 660～1 680 cm-1歸屬β-轉(zhuǎn)角、1 680～1 700 cm-1歸屬β-逆折疊[15]進行歸類計算二級結構組成。

1.2.6 花生蛋白質(zhì)的變性電泳測定 分別取0.1 g樣品加入2 mL樣品處理液(0.02 g/mL SDS、0.05 g/mL β-巰基乙醇、0.001 g/mL溴酚藍、0.10 g/mL甘油、0.05 mol/L pH值為 6.8的 Tris-HCl)，100 ℃水浴加熱3 min，10 000 r/min離心10 min,取上清液，用于電泳。電泳條件：3%濃縮膠濃度、10%分離膠、取5 μL上清液上樣，濃縮膠時采用15 mA，分離膠時采用30 mA。電泳完畢后，迅速將凝膠采用考馬斯亮藍R-250溶液染色60 min，收集染色液，隨后加入脫色液在搖床上脫色[16]。膠片在凝膠成像系統(tǒng)中拍攝并用Image Lab 5.0進行分析。

1.2.7 蛋白質(zhì)凝膠質(zhì)構測定 為評價改性對花生蛋白質(zhì)凝膠性的影響，以大豆蛋白質(zhì)作為對照，分別配制150 g/L的大豆與花生蛋白質(zhì)溶液，將蛋白質(zhì)溶液在90 ℃加熱40 min，隨后用冰水浴迅速將凝膠冷卻至室溫，最后將樣品放入4 ℃冰箱過夜[17-18]。二次壓縮試驗前，在室溫下靜置1 h，測定時采用Φ50 mm圓形探頭、壓縮距離10 mm、前進速度60 mm/min、壓縮速度60 mm/min、后退速度60 mm/min，計算硬度、黏附力、黏附性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性。

1.2.8 蛋白質(zhì)的功能特性 為考察改性對花生蛋白質(zhì)功能特性的影響，分別測定花生蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性[19-20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.2進行Box-Behnken設計的響應面分析，以Duncan’s法進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 TGase改性花生蛋白質(zhì)最優(yōu)條件的確立

通過對響應面試驗結果(表2)進行方差分析發(fā)現(xiàn)：以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率為因變量的回歸模型高度顯著(P<0.01),且失擬項P=0.06>0.05(表3)，表明該模型可以客觀地反映改性因素對改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率的影響規(guī)律，并且由于R2為0.992 4(調(diào)整R2為0.978 8)，因此，模型的回歸方程能夠準確反映改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率的變化趨勢，以確立最佳的TGase改性條件，獲得的回歸方程如下：

表2 花生蛋白質(zhì)TGase改性響應面分析試驗設計及結果

注：括號中數(shù)字為試驗編碼值。

在響應面考察的因素變化范圍中，加酶量和pH值是高度顯著因素(P<0.01)，且pH值的影響大于加酶量，酶解時間是非顯著影響因素(P>0.05)；同時，因素間的交互作用不顯著(表3)。

分析持水能力發(fā)現(xiàn)，模型高度顯著(P<0.01)，且失擬項P=0.10>0.05，說明模型能夠客觀反映改性因素與改性蛋白質(zhì)持水能力的關系，其中反應時間是第一影響因素，pH值是第二影響因素，加酶量是第三影響因素(表3)。此外，由于R2=0.985 3，調(diào)整R2=0.958 9，表明該回歸模型的回歸曲線可以預測持水能力的變化趨勢，方程回歸模型如下：

表3 TGase改性因素對改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力影響的方差分析

注：以改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率為因變量的回歸模型R2為0.992 4(調(diào)整R2為0.978 8)，以持水能力為因變量的回歸模型R2為0.985 3(調(diào)整R2為0.958 9)；*、**分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著、極顯著。

由于酶解時間對改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率是非顯著影響因素，固定酶解時間45 min，分析加酶量與pH值對改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力的影響。由圖1a、圖1b可知，pH值7.7～8.3時，加酶量增加可以提高改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力，且當pH值在8.0以上時，增加加酶量能更有效地促進改性蛋白質(zhì)形成、改善持水能力(圖1c、圖1d))。增加加酶量可以提高酶分子與底物碰撞的概率，從而加速TGase改性反應，提高改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率，且隨著加酶量的增加，也會促進TGase催化已改性的花生蛋白質(zhì)繼續(xù)形成分子間、分子內(nèi)的共價交聯(lián)，從而使蛋白質(zhì)凝聚團更加致密，提高持水能力。在高pH值條件下，增加加酶量能更有效地促進酶解反應的原因可能是，在堿性條件下，TGase的活性中心更加暴露，有利于酶解反應的進行，從而提高改性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。由圖1可知，獲得高改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率的試驗條件與獲得高持水能力的試驗條件存在差異，當pH值為8.0～8.1時產(chǎn)生高持水能力的凝膠團，而pH值為8.1～8.2時，改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率最高。這可能是蛋白質(zhì)凝聚方式改變引起的差異，花生蛋白質(zhì)的等電點(pI)在4.5左右[21]，當pH值大于pI時，花生蛋白質(zhì)帶負電，且隨pH值偏離pI程度越大，蛋白質(zhì)所帶電荷極性越強。當?shù)鞍踪|(zhì)帶有較強的同性電荷，由于排斥力作用，蛋白質(zhì)分子間凝聚速度減慢，削弱蛋白質(zhì)分子間的鏈接，導致蛋白質(zhì)凝膠團緊密程度下降，從而導致持水能力下降[22]。

SAS分析顯示，在取值范圍內(nèi)，TGase改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率存在最大值，預測最高產(chǎn)率為(83.19±0.66)%，對應的反應條件為：加酶量為144.16 U/g，pH值為8.17，反應時間為45.96 min。由于持水能力在取值范圍內(nèi)僅存在鞍點，故僅以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率為優(yōu)化目標，根據(jù)實際情況，對最佳酶解因素進行調(diào)整如下：加酶量為144.20 U/g，pH值8.15，時間為46 min，在此條件下，產(chǎn)率為(83.17±0.38)%，持水能力為(45.63±0.24)%。

2.2 TGase改性對花生蛋白質(zhì)結構的影響

2.2.1 微觀結構 采用電子顯微鏡觀察未改性花生蛋白質(zhì)與改性花生蛋白質(zhì)的形態(tài)發(fā)現(xiàn)：未改性花生蛋白質(zhì)顆粒為表面凹凸不平的球體(圖2a)，而改性花生蛋白質(zhì)顆粒體積增加(圖2c)，且改性后的花生蛋白質(zhì)表面的結構更加粗糙且凹凸不平(圖2d)。上述結果表明，TGase改性會改變蛋白質(zhì)微觀結構，這與張春紅等[23]采用TGase改性花生蛋白質(zhì)膜會改變原有微觀結構的報道一致。

2.2.2 二級結構 由表4知，在TGase改性過程中，α-螺旋、無規(guī)卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角隨改性時間延長均有所下降，其中β-轉(zhuǎn)角下降程度明顯；而β-逆折疊則顯著提高，從未改性的16.25%上升到改性45 min的22.90%，經(jīng)過TGase改性后，花生蛋白質(zhì)的二級結構組成接近大豆蛋白質(zhì)。推測由于TGase催化產(chǎn)生新的共價聯(lián)結，導致形成新的空間位阻，造成花生蛋白質(zhì)的多肽鏈伸展方向與彎曲方式發(fā)生變化。另外，對比大豆蛋白質(zhì)的二級結構組成，未變性的花生蛋白質(zhì)與其存在顯著差異。

圖1 加酶量和pH值對改性花生蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力的影響

a、b為花生蛋白質(zhì)(×500、×2 000)； c、d為TGase改性花生蛋白質(zhì)(×500、×2 000)圖2 花生蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)的微觀結構

樣品改性時間/minβ-折疊無規(guī)卷曲α-螺旋β-轉(zhuǎn)角β-逆折疊 大豆蛋白質(zhì)29.82±0.42b10.75±0.55b12.50±0.78d25.47±0.53d21.52±0.33c花生蛋白質(zhì)030.49±0.72a11.27±0.15a14.84±0.14a27.15±0.08a16.25±0.35h530.51±0.39a11.08±0.05ab14.52±0.54a26.57±0.09ab17.31±0.30g1029.81±0.25b11.23±0.16a14.45±0.59a26.30±0.30bc18.21±0.13f1529.66±0.04b11.11±0.10ab14.10±0.42ab26.35±0.37bc18.79±0.12f

續(xù)表4 大豆蛋白質(zhì)與TGase改性花生蛋白質(zhì)的二級結構 %

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.2.3 亞基組成 由圖3可知，隨著改性時間的延長，花生蛋白質(zhì)的亞基組成發(fā)生明顯變化，除了原有的花生球蛋白質(zhì)、伴花生球蛋白質(zhì)Ⅰ和Ⅱ以外，還產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于70 ku的高分子蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)含量也逐漸增加。高分子蛋白質(zhì)是TGase催化花生蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間形成共價交聯(lián)的產(chǎn)物。上述發(fā)現(xiàn)與前人研究TGase改性乳蛋白質(zhì)的亞基組成變化相似[24-25]。

泳道1為標準蛋白質(zhì)； 泳道2—7分別為TGase改性0、5、15、25、35、45 min的花生蛋白質(zhì)圖3 TGase改性花生蛋白質(zhì)的變性電泳圖

2.3 TGase改性對花生蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

由表5可知，通過經(jīng)過TGase改性后，花生蛋白質(zhì)凝膠硬度、黏附力、黏附性、膠黏性顯著提高，但內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性顯著下降，表明TGase可以部分改善花生蛋白質(zhì)的凝膠性。與大豆蛋白質(zhì)形成的凝膠相比，TGase改性花生蛋白質(zhì)形成的凝膠硬度高、彈性差、咀嚼性差，這說明改性花生蛋白質(zhì)形成的凝膠性質(zhì)與大豆蛋白質(zhì)凝膠存在明顯差異，產(chǎn)生上述差異的原因是蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)除受蛋白質(zhì)結構的影響外，還受氫鍵、二硫鍵、疏水表面積、鹽離子、加工條件等因素影響?？梢?，TGase改性花生蛋白質(zhì)可以提高凝膠性，但形成的凝膠硬度高而彈性差，不耐咀嚼，需要采用其他方法來進一步改善花生蛋白質(zhì)凝膠特性。

表5 TGase改性對花生蛋白質(zhì)凝膠質(zhì)構特性的影響

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

由表6可知，通過TGase改性的花生蛋白質(zhì)的吸水性、吸油性有了明顯提高，分別較花生蛋白質(zhì)提高到1.41、1.30倍，這表明通過TGase改性使蛋白質(zhì)分子間與分子內(nèi)形成更多的共價聯(lián)結，使其形成了更加嚴密與完整的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結構，從而提高對水、油的包覆能力。但改性會降低花生蛋白質(zhì)乳化能力與起泡能力，這可能是TGase催化導致形成了高分子質(zhì)量花生蛋白質(zhì)聚合物，這類蛋白質(zhì)在溶液、界面中不穩(wěn)定，易聚集、沉淀析出，從而削弱了蛋白質(zhì)的乳化能力[26]。此外，由于高分子蛋白質(zhì)的形成會降低蛋白質(zhì)在界面重新排列的能力，從而削弱界面膜的穩(wěn)定性，造成蛋白質(zhì)起泡能力下降。上述結果與前人報道相一致[20,26]。

表6 TGase改性對花生蛋白質(zhì)功能性的影響 %

3 結論與討論

本研究以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力為評價指標，確定TGase改性花生蛋白質(zhì)的最佳工藝為：70 g/L 花生蛋白質(zhì)溶液在加酶量為144.20 U/g、pH值 8.15、反應溫度45 ℃、反應時間46 min條件下,改性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率為(83.17±0.38)%。通過電子顯微鏡、紅外光譜與變性電泳分析改性對花生蛋白質(zhì)結構的影響，結果表明：TGase改性會增加蛋白質(zhì)顆粒的尺寸，并增加表面的粗糙程度；同時，花生蛋白質(zhì)中β-轉(zhuǎn)角比例下降；而β-逆折疊顯著提高，經(jīng)過TGase改性后，花生蛋白質(zhì)的二級結構組成接近大豆蛋白質(zhì)；另外，花生蛋白質(zhì)的原有亞基無明顯變化，但有TGase催化產(chǎn)生高分子蛋白質(zhì)。上述結構變化使改性前后的花生蛋白質(zhì)功能特性產(chǎn)生差異，改性后的花生蛋白質(zhì)凝膠特性有部分改善，其硬度、黏附性、膠黏性顯著提高，吸油性、吸水性也有大幅提高，但乳化能力與起泡能力明顯降低。

與前人研究相比，本研究以改性蛋白質(zhì)產(chǎn)率與持水能力作為評價指標，彌補了傳統(tǒng)TGase改性蛋白質(zhì)采用黏度作為評價指標時結果隨機性大的缺點，為客觀分析TGase改性花生蛋白質(zhì)提供了可靠途徑。同時，確定的最優(yōu)工藝也為TGase改性花生蛋白質(zhì)的工業(yè)化轉(zhuǎn)化提供了參考。本研究雖然分析TGase改性前后花生蛋白質(zhì)結構與功能的變化，但并未量化花生蛋白質(zhì)結構變化與功能特性間的關系，這方面的研究需要進一步開展。