吳光松，李 平，顧麗菊，林鵬飛，任麗群，楊 蓉，黃維江，張 蕓，毛同輝，魏小紅，田松軍，燕志宏*

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 550018； 4.貴州優(yōu)農(nóng)谷生態(tài)產(chǎn)業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550001； 5.貴州省農(nóng)業(yè)區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展中心，貴州 貴陽 550001； 6.銅仁市畜牧技術(shù)推廣站，貴州 銅仁 554300； 7.紫云自治縣畜牧服務(wù)中心，貴州 安順 550800)

二?；视王；D(zhuǎn)移酶(Diacylglycerol acyltrabsferase，DGAT)是一種微粒體酶，是脂肪細胞中控制甘油三酯(Triglyceride，TG)合成最后一步的反應(yīng)酶，同時也是TG合成過程中唯一的關(guān)鍵酶和限速酶[1]。DGAT1基因廣泛表達于動物體各組織器官中，它的表達量與TG的代謝作用相偶聯(lián)。研究表明，在小鼠脂肪組織和骨骼肌中過表達DGAT1，可使甘油二酯(Diglyceride，DG)攝取量和TG合成量顯著增加[2-3]。Lardizabal等[4]在真菌中分離出DGAT1后，又克隆得到一種未知酶的cDNA序列，這種未知酶即為DGAT2。DGAT2對于體內(nèi)基本TG的合成和儲存有重要作用，DGAT2基因敲除的小鼠脂肪含量少，同時其組織中TG的含量明顯減少[5]。DGAT2在腸脂肪吸收、脂蛋白集合、血漿TG濃度的調(diào)節(jié)及脂肪細胞脂肪的儲存、肌肉能量的代謝中扮演著重要的角色[6-7]。Renaville等[8]通過研究指出，DGAT2基因與育肥豬的背膘厚度呈正相關(guān)。Harris等[9]研究DGAT1和DGAT2基因?qū)χ炯毎蠺G的合成和脂滴(Lipid droplet，LD)形成的影響時，發(fā)現(xiàn)分別敲除DGAT1和DGAT2中的1個基因，脂肪細胞中仍能合成TG，并伴有脂滴的形成，當(dāng)同時敲除這2個基因時，脂肪細胞中不能合成TG，胞內(nèi)也沒有脂滴形成。胡悅等[10]對萊蕪豬和杜洛克背膘組織DGAT1和DGAT2基因表達變化進行比較，指出DGAT2基因在豬脂肪沉積中的作用更重要。

目前，已有諸多研究者將DGAT1和DGAT2作為脂肪沉積候選基因進行研究。但在原代細胞中研究DGAT1和DGAT2基因的報道較少。本研究探討在豬原代肝細胞中干擾DGAT1和DGAT2的表達對脂肪沉積效率的影響，以期對進一步研究降低豬脂肪沉積打下堅實基礎(chǔ)，為豬的遺傳育種提供可行性參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 載體及試驗動物 pGPU6/GFP/Neo載體購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，3日齡宗地花豬由貴州紫薇畜牧業(yè)開發(fā)有限公司豬場提供。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒抽提試劑盒、紅細胞裂解液購自天根生化科技(北京)有限公司；Ⅳ型膠原酶購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25% Trypsin EDTA、Opti-MEM?Ⅰ Reduced Serum Medium購自Gibco公司；Lipofectamine?3000、TRIZOL購自Invitrogen公司；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；甘油三酯測試盒、總膽固醇(T-CHO)測試盒購自南京建成生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬原代肝細胞的分離培養(yǎng) 采用膠原酶消化提取豬肝臟細胞：仔豬禁食12 h，禁水4 h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取出肝臟，生理鹽水清洗，去除白色結(jié)締組織；將肝臟組織剪碎，加入3～5倍體積0.1% Ⅳ型膠原酶消化液，置于37 ℃水浴鍋中消化35～45 min，每隔10 min搖晃1次，使細胞分散，加入等體積培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)終止消化；用76 μm無菌細胞篩過濾，獲得的肝細胞懸液600 r/min離心8 min，棄上清；加入紅細胞裂解液裂解5 min，600 r/min離心5 min，重復(fù)此步驟；用含DMEM/F12完全培養(yǎng)基將細胞沉淀制成細胞懸液，觀察細胞存活情況；接種后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況。

1.2.2DGAT1和DGAT2基因干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)豬DGAT1和DGAT2 mRNA序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司分別設(shè)計并合成3條短發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA，shRNA)序列及1條陰性對照序列(表1)，結(jié)構(gòu)為：CACC+Sense+loop+Antisense+終止信號+BamHⅠ，其中的莖環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA以避免形成終止信號，轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈序列的5′端添加了CACC，與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補，反義鏈序列的5′端添加了GATC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補。

表1 DGAT1和DGAT2基因shRNA靶位點序列

注：NC為陰性對照，下劃線為基因靶序列。

將合成的shRNA正反向寡核苷酸鏈退火后連接到pGPU6/GFP/Neo載體上，酶切鑒定初步判斷正確后進行測序，測序檢驗正確后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光定量PCR篩選DGAT1和DGAT2基因最佳干擾載體 選擇生長狀態(tài)良好的豬肝細胞，0.25%胰蛋白酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯合度達到70%～90%時，按照Lipofectamine?3000試劑盒操作說明，分別轉(zhuǎn)染DGAT1和DGAT2基因重組干擾載體和陰性對照載體，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染24 h后開始在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

轉(zhuǎn)染48 h時，提取細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)豬DGAT1、DGAT2和GAPDH基因的mRNA序列分別設(shè)計熒光定量PCR引物(表2)，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表2 DGAT1、DGAT2和GAPDH基因引物信息

熒光定量PCR 20 μL反應(yīng)體系：2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，RNase-free H2O 7 μL。PCR程序采用兩步法：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，59.5 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。熒光信號采集溫度范圍為65～95 ℃，每隔5 s采集一次，溫度梯度為5 ℃，試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。采用2-△△Ct法進行相對定量分析，從而篩選出DGAT1和DGAT2基因的最佳干擾載體。

1.2.4DGAT1和DGAT2基因干擾載體對細胞脂質(zhì)性狀的影響 利用上一步中篩選出的最佳干擾載體分別轉(zhuǎn)染肝細胞，48 h后收集細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作說明測定并計算各脂質(zhì)指標含量。

1.3 統(tǒng)計分析方法

用Excel對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬原代肝細胞的形態(tài)學(xué)特征

分離獲得的肝細胞(圖1)生長狀態(tài)良好，呈不規(guī)則形狀向四周伸展，細胞間連接緊密，大量新生細胞積聚呈島狀。

圖1 豬原代肝細胞形態(tài)觀察(100×)

2.2 DGAT1和DGAT2基因最佳干擾載體的篩選

將酶切初步鑒定正確并且測序鑒定也正確的重組干擾載體分別轉(zhuǎn)染至豬肝細胞中，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況如圖2所示，轉(zhuǎn)染48 h時肝細胞可看到熒光。

圖2 轉(zhuǎn)染48 h熒光檢測結(jié)果(100×)

RNA提取結(jié)果顯示，總RNA的OD260/280值均在1.8～2.0，說明所得RNA不含雜質(zhì)，純度較高。熒光定量PCR結(jié)果(表3)顯示，原代肝細胞中陰性對照組載體表達量與空白組無明顯差異，而DGAT1和DGAT2的干擾載體組與空白對照和陰性對照相比，表達量差異均達到極顯著水平(P<0.01)；DGAT1基因的3個干擾載體均能使肝細胞中DGAT1 mRNA表達水平下調(diào)，下調(diào)量最高為78.45%，抑制效率最佳載體為pGPU6/GFP/Neo-DGAT1-1；DGAT2基因的最佳干擾載體為pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-1，下調(diào)量最高為87.52%。

表3 轉(zhuǎn)染重組載體后肝細胞中DGAT1和

注：同一基因相對表達量數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 DGAT1和DGAT2基因最佳干擾載體對細胞脂質(zhì)性狀的影響

檢測結(jié)果(表4)顯示，轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-DGAT1-1和pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-1干擾載體后，肝細胞培養(yǎng)液中TG含量均降低。其中，轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-1后，細胞培養(yǎng)液中TG含量顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染前后肝細胞培養(yǎng)液中總膽固醇含量差異不顯著(P>0.05)，轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-1的總膽固醇含量略有降低(P>0.05)。

表4 細胞培養(yǎng)液中TG和總膽固醇含量檢測結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

肝臟和脂肪是TG代謝比較旺盛的組織，研究證實肝臟和脂肪中DGAT1和DGAT2基因的表達量較高[11-12]。DGAT1和DGAT2基因的表達量升高，可促進細胞TG的合成以及脂肪的沉積[13-14]。為了探索DGAT1和DGAT2基因?qū)ψ诘鼗ㄘi脂肪沉積效率的影響，本試驗成功構(gòu)建DGAT1和DGAT2基因的干擾載體，所構(gòu)建的6個載體均能顯著抑制豬肝細胞中目的基因的表達，其中針對同一靶基因不同靶位點設(shè)計的shRNA沉默效率不同，pGPU6/GFP/Neo-DGAT1-1和pGPU6/GFP/Neo-DGAT2-1的抑制效率最高，分別為78.45%和87.52%，說明干擾載體構(gòu)建成功。

目前，已有大量的分子遺傳學(xué)試驗研究表明，DGAT1和DGAT2基因的表達水平或多態(tài)性與脂肪和能量的代謝有關(guān)。Jeong等[15]研究結(jié)果表明，DGAT1和DGAT2基因的表達水平與牛背最長肌的肌內(nèi)脂肪含量呈顯著的正相關(guān)。DGAT1在乳腺的類脂代謝中起著重要作用，其多態(tài)性與乳中脂肪酸組成呈強正相關(guān)關(guān)系[16]。Roorda等[17]在活體動物骨骼肌中過表達DGAT1基因，證實了DGAT1基因?qū)?nèi)脂肪沉積具有促進作用。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制DGAT2基因表達后，肝細胞培養(yǎng)液中TG和總膽固醇的合成量略低于DGAT1基因抑制組，這與DGAT2基因在TG的基礎(chǔ)合成中起著主要作用有關(guān)。本研究中膽固醇的含量變化不大，這可能與本試驗在細胞培養(yǎng)液中開展有關(guān)。

本試驗結(jié)果表明，抑制DGAT1和DGAT2基因的表達可在一定程度上降低肝細胞培養(yǎng)液中TG和總膽固醇含量。通過抑制豬DGAT1和DGAT2基因的表達，可減少體內(nèi)TG的合成和脂肪的沉積，為今后宗地花豬育種提供有效指導(dǎo)思路。