齊建雙，谷利敏，夏來坤

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002)

優(yōu)質蛋白質玉米(QPM)中富含賴氨酸和色氨酸，其生物效應和營養(yǎng)價值比普通玉米高。我國自20世紀70年代初開始研究優(yōu)質蛋白質玉米，先后培育出了一大批的優(yōu)質蛋白質玉米品種，但這些品種均未得到大面積推廣種植，原因是這些品種多多少少都存在一定的缺陷?？傮w來說，我國早期育成的高賴氨酸玉米品種的賴氨酸含量達標，但胚乳硬質度不達標，由于籽粒容重下降，這類品種產(chǎn)量比普通玉米低10%左右；近期育成的優(yōu)質蛋白質玉米品種有的是胚乳硬度達標，賴氨酸含量稍低，也有少部分品種是賴氨酸和胚乳硬度都達標，但種植范圍有限制，在夏季高溫多雨的地區(qū)因易感穗腐病而無法種植。由此可見，優(yōu)質蛋白質玉米在o2o2純合背景下表現(xiàn)出來的籽粒容重低、粉質不透明、易感穗腐病等不良性狀一直是影響其大面積推廣種植的一個瓶頸問題。為解決這一難題，國內外研究人員進行了大量研究。1969年，Paez等[1]首先發(fā)現(xiàn)o2胚乳修飾基因Opm，將Opm導入o2突變體后選育出高賴氨酸的QPM，其籽粒賴氨酸含量達到 0.40%以上，同時胚乳硬質度也大大提高。但由于Opm包含多個遺傳位點，導致Opm的修飾效應不同，不同遺傳背景(也有的認為是不同粒型)的材料含有o2修飾基因的數(shù)量不同，改良效果也不盡相同[2-4]。石德權等[5]、楊引福等[6]、宋同明等[7]從修飾基因的利用實踐中指出，修飾基因的頻率決定o2玉米胚乳透明度，增加胚乳硬質度，雖籽粒物理性狀得到改良，但賴氨酸含量有下降趨勢。2010年，據(jù)美國物理學家組織網(wǎng)(http：//phys.org)報道，美國研究人員發(fā)現(xiàn)，γ醇溶蛋白(γ-zein)會使玉米籽粒更加堅硬。2016年Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質蛋白質玉米胚乳發(fā)育過程中，27 ku γ-zein的轉錄和蛋白質表達水平是野生型和o2突變體的 2～3倍，RNAi沉默后優(yōu)質蛋白質玉米籽粒重新由硬質變?yōu)檐涃|，同時證明了27 ku γ-zein的調控因子(qγ27)為順式調控元件，屬于基因劑量效應調控。27 ku γ-zein 基因所在的QTL是調控修飾o2胚乳最重要的位點之一[9]。也有研究想直接避開胚乳硬質度和賴氨酸含量的矛盾，如高樹仁[10]認為，以普通玉米與o2玉米自交系組配雜交種是一種值得探討的高賴氨酸玉米選育方法。關于這個問題的研究還有很多，這些研究總結起來一致認為，賴氨酸含量與胚乳的硬質程度呈負相關，這是一對事實存在的矛盾。但對在o2o2純合背景下賴氨酸含量與胚乳硬質度表達的研究還相對比較薄弱。鑒于此，選用遺傳背景清晰、育種上廣泛應用的幾個材料及其組合進行研究，揭示純合o2o2背景下玉米胚乳硬質度與賴氨酸含量的遺傳規(guī)律，為優(yōu)質蛋白質玉米育種提供一定的借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

普通玉米骨干自交系鄭58、昌7-2和掖478以及由它們作為輪回親本回交轉育成的高賴氨酸近等基因系QZ58、QC72、Q478家系各10個；高賴氨酸供體自交系齊205、CA042；由齊205、QZ58、QC72和Q478根據(jù)雜種優(yōu)勢模式組配的組合4套，分別為QZ58×齊205、QZ58×QC72、QC72×QZ58和Q478×QC72。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗 雜交組合組配：選長勢一致的父本穗行混合取粉，與對應的母本雜交，收獲時按行收獲考種，測量籽粒容重。F2代試驗：按收獲的穗行種植，每個組合各種植10個穗行。采用與大田普通玉米錯期播種的試驗方案，完全隨機設計，4行區(qū)，3次重復。行長4 m，行距0.6 m，株距0.25 m。每個雜交組合在邊行套袋自交6穗以備檢測籽粒賴氨酸含量，收獲時每小區(qū)取中間2行從第4株開始連續(xù)收獲10穗，進行測產(chǎn)并測量籽粒容重。

1.2.2 分子標記鑒定 SSR標記選用齊建雙[4]已建立的MAS技術體系的o2基因內標記umc1066。

1.2.3 容重測定 按照GB/T 5498—2013測定。

1.2.4 賴氨酸含量測定 用MATRIX-I近紅外光譜分析儀采用籽粒無破損法測定。將收獲的F2代自交籽粒按照不同的雜交組合進行混合，每個雜交組合取3份，每份混勻測量3次，求其平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記基因型鑒定

回交轉育的近等基因系基因型檢測以QC72家系為例(圖1)。回交轉育成的QC72家系在o2位點純合。同樣，QZ58和Q478家系在o2位點也都達到隱性純合。

2.2 雜交一代(F1)玉米胚乳硬質度表現(xiàn)

隱形突變基因(例如sh2和wx)在接受了普通玉米的花粉后，會產(chǎn)生花粉直感使雜交后代籽粒變成普通玉米。同樣，o2o2基因純合材料在接受了普通玉米的花粉后，也會產(chǎn)生花粉直感使F1代種子表現(xiàn)為硬質程度很高的普通玉米籽粒。但雙親均為o2o2基因純合且胚乳硬質程度差別較大的2個自交系雜交，F(xiàn)1代種子胚乳硬質度表現(xiàn)尚不明確。

在以往的研究[2-4]中已經(jīng)得知，o2o2基因純合試驗材料中QC72家系的胚乳硬質度比QZ58家系高得多。根據(jù)試驗結果(圖2)發(fā)現(xiàn)，在o2o2背景下，2個近等基因系正反交得到的雜交F1代種子胚乳硬質度存在較大差異：以胚乳硬質度高的QC72家系作父本時，F(xiàn)1代籽粒的硬質程度較低，與其母本QZ58家系接近；反過來，而以胚乳硬質度高的QC72家系作母本時，F(xiàn)1代的籽粒胚乳硬質度較高，與其母本QC72家系接近。這說明在o2o2基因純合背景下，F(xiàn)1代種子胚乳硬質度具有母本效應，沒有花粉直感效應。這與Pixley[11]、楊引福等[12]、齊建雙等[13]的結論吻合。

P1：普通玉米自交系昌7-2； P2：高賴氨酸供體親本CA042； 95—102：QC72家系中的8個單株圖1 普通昌7-2及QC72家系SSR檢測結果

圖2 o2o2基因純合的QC72與QZ58家系正反交示意

2.3 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合F2代玉米籽粒容重、賴氨酸含量的方差分析

由表1、2可以看出，4個不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合的重復之間容重和賴氨酸含量差異均不顯著。說明在o2o2基因純合背景下，雜交組合的籽粒胚乳硬質度和賴氨酸含量受小環(huán)境影響不大，所以雜交組合之間胚乳硬質度、賴氨酸含量的差異均由基因型差異引起。

表1 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合F2代玉米籽粒容重方差分析

表2 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合F2代玉米籽粒賴氨酸含量方差分析

2.4 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合近等基因系家系內部F2代玉米籽粒容重、產(chǎn)量、賴氨酸含量的方差分析

在4個不同雜交類群雜交組合各10個近等基因系家系內部，對F2代容重、產(chǎn)量和賴氨酸含量分別做方差分析，結果(表3)表明：不同雜交類群雜交組合家系內部的雜交組合之間產(chǎn)量差異均未達到顯著水平，賴氨酸含量也只有Q478×QC72達到顯著水平。但雜交組合QZ58×齊205、QZ58×QC72、Q478×QC72近等基因系家系內部容重差異均達到極顯著水平。也就是說，這4個雜交組合近等基因系家系內部的10個穗行之間籽粒產(chǎn)量和賴氨酸含量差異均較小，只有容重存在較大差異。因此，在賴氨酸含量沒有顯著差異的QZ58×齊205、QZ58×QC72、QC72×QZ58中可以找到胚乳硬質度較高的近等基因系家系雜交組合，解決賴氨酸含量與胚乳硬質度的矛盾。

表3 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合近等基因系家系內部F2代玉米容重、產(chǎn)量和賴氨酸含量的方差分析

注：*表示在5%水平顯著，**表示在1%水平極顯著，下同。

2.5 F2代籽粒賴氨酸含量與F1容重、F2容重之間的關系

對F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量三者做相關分析，結果(表4)表明：F2代籽粒賴氨酸含量與F1容重、F2容重均呈負相關，但與F2容重未達到顯著水平，僅與F1容重達到了顯著水平，但決定系數(shù)(R2=10.24%)不大；F1容重與F2容重呈正相關，未達到顯著水平。由此可見，F(xiàn)2容重與F2賴氨酸含量之間沒有直接的決定關系，賴氨酸含量與胚乳硬質度的關系并不十分密切。

表4 F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量之間的相關性分析

2.6 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量平均值多重比較

從表5可見，4個不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合F1容重平均值表現(xiàn)為QC72×QZ58組合極顯著高于QZ58×齊205、QZ58×QC72、Q478×QC72組合，QZ58×QC72、Q478×QC72組合顯著高于QZ58×齊205組合。F2容重平均值表現(xiàn)為Q478×QC72組合顯著高于QZ58×齊205、QZ58×QC72組合，極顯著高于QC72×QZ58組合。F2賴氨酸含量平均值表現(xiàn)為Q478×QC72組合顯著高于QC72×QZ58組合，極顯著高于QZ58×QC72組合，與QZ58×齊205組合差異不顯著。其中，雜交組合QZ58×QC72與QC72×QZ58是胚乳硬質度有較大區(qū)別的2個親本的正反交組合，其F1容重存在極顯著差異，但F2代容重與F2代賴氨酸含量差異均未達到顯著水平。雜交組合Q478×QC72 F2代容重在4個類群雜交組合中最大，賴氨酸含量也最高，表明o2o2基因純合背景下雜交組合的容重和賴氨酸含量可以達到完美結合。

表5 不同雜種優(yōu)勢類群雜交組合的F1容重、F2容重與F2賴氨酸含量

注：同列不同大、小寫字母分別表示在0.01、0.05水平上差異極顯著、顯著。

3 結論與討論

玉米籽粒是玉米的主要儲藏器官，是玉米產(chǎn)量的直接決定因素，胚乳是主要的儲藏物積累場所[14]，胚乳的質量直接決定著玉米的品質。普通玉米的胚乳蛋白質中有70%賴氨酸含量很低的醇溶蛋白，o2突變體能夠降低這類醇溶蛋白的合成，同時顯著增加非醇溶蛋白的含量，從而極大地提高籽粒中賴氨酸和色氨酸的含量[15-16]，進而改善玉米胚乳的品質。而玉米胚乳的硬質度決定著玉米的儲藏品質。因此，選育出賴氨酸含量高、胚乳硬質度較高的優(yōu)質蛋白質玉米新品種才能滿足市場的需要。本研究結果表明，在純合o2o2背景下，F(xiàn)2代籽粒賴氨酸含量與F2代籽粒容重呈不顯著負相關，證明玉米籽粒胚乳硬質程度與賴氨酸含量這對矛盾是可以化解的，這與胚乳修飾基因可以改變玉米籽粒胚乳硬質度而賴氨酸含量不明顯降低的結論是一致的。因此，在育種的過程中，應該選擇合適的遺傳材料(如硬粒型材料，在回交轉育的近等基因系后代中會出現(xiàn)從軟質到硬質的一系列胚乳變異[2])，同時注意胚乳修飾微效基因的頻率積累。

胚乳修飾基因自1969年被發(fā)現(xiàn)以來已有近50 a 的研究歷程，但研究進展較慢且大部分研究集中在國外[17]，利用效率也較低。在我國，優(yōu)質蛋白質玉米的主要研究方法還是通過分子標記輔助選擇和常規(guī)育種技術相結合對普通玉米核心自交系進行回交轉育[3，18-19]，這種方法的局限性在于，在回交轉育的過程中不僅將高賴氨酸基因轉進了普通玉米自交系，同時部分不利基因也會轉育進去，導致回交轉育成的高賴氨酸近等基因系的配合力下降，利用效率降低。隨著轉基因等現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，利用更先進的方式快速發(fā)掘胚乳修飾基因，將高賴氨酸基因和胚乳修飾基因同時轉入普通玉米自交系，將是未來優(yōu)質蛋白質玉米育種的主要方向。