朱明明,何鴻舉,*,樊明濤,冉軍艦,馬漢軍

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)又名醋柳、酸棘、沙棗等[1],起源于歐亞大陸,而后種植于許多國家,包括羅馬尼亞、印度、中國、尼泊爾、巴基斯坦、德國、芬蘭、法國等[2]。沙棘果因其富含微量元素、油脂及其化合物、維生素C、類胡蘿卜素、多酚等[3-4]而備受關(guān)注。其中沙棘多酚,尤其是黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、護(hù)肝及提高免疫力等重要作用[5-6]。有研究表明沙棘果可治療多種疾病,包括心血管疾病和癌癥等[7-9]。因此開發(fā)沙棘功能性食品成為當(dāng)前的研究熱點。

沙棘果經(jīng)發(fā)酵或半發(fā)酵釀造成低度沙棘果酒,具有一定的生理功能如抗氧化特性[10-11],有研究表明果酒的高抗氧化性可降低慢性病的病發(fā)率,包括冠心病、中風(fēng)和癌癥[12]。然而,由于沙棘果中富含有機酸,導(dǎo)致沙棘果酒存在著酸澀和香味寡淡等缺陷而不被消費者所接受[13]。有學(xué)者通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵來改善沙棘果酒酸澀的問題[14]。針對香味寡淡的問題,有研究通過生物、化學(xué)手段催化沙棘果酒中富含的類胡蘿卜素(4.075 mg/L)[15]部分降解產(chǎn)香來實現(xiàn)[16-17]。利用類胡蘿卜素降解產(chǎn)香的作用依據(jù)是由于類胡蘿卜素除了自身具有抗氧化、抗癌、保護(hù)視力等功能特性[18-19]外,還可氧化降解生成將異戊二烯類香氣物質(zhì)[20],如β-大馬酮和β-紫羅蘭酮等,其在水中具有極低的香氣閾值及特殊香氣表征而成為果酒香氣中必不可少的成分[21]。但關(guān)于添加葡萄球菌在沙棘果酒中,以達(dá)到催化類胡蘿卜素降解產(chǎn)香的報道幾乎沒有。

本課題組從沙棘中首次分離得到一株高效降解類胡蘿卜素的菌株TS-82,鑒定為巴氏葡萄球菌(GenBank Accession No. KP171185)[22]。研究表明其不具備致病性[22],可用于食品加工中,其所產(chǎn)類胡蘿卜素降解酶可催化類胡蘿卜素降解產(chǎn)香[23-24]。因此將巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵釀造沙棘果酒,結(jié)果表明部分類胡蘿卜素降解,并產(chǎn)生特征性的香氣物質(zhì),有效改善沙棘果酒的風(fēng)味[25]。本文在此基礎(chǔ)上,研究巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵(方法Ⅱ)、添加類胡蘿卜素降解酶發(fā)酵沙棘果酒(方法Ⅲ),與傳統(tǒng)發(fā)酵方法(方法Ⅰ)相比,對沙棘果酒理化性質(zhì)、多酚含量、黃酮含量及抗氧化性的影響,以期在改善果酒風(fēng)味的同時,確保適口、安全、營養(yǎng)豐富,研制出受消費者歡迎的新型沙棘果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏葡萄球菌TS-82(StaphylococcuspasteuriTS-82) 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品發(fā)酵與生物技術(shù)實驗室分離保存;釀酒酵母 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品發(fā)酵與生物技術(shù)實驗室保藏菌種;沙棘果汁 采自青海的新鮮沙棘果經(jīng)壓榨而成;沒食子酸、蘆丁標(biāo)品 購自Sigma-Aldrich;福林酚試劑 購自北京索萊寶;葡萄糖、NaOH、無水碳酸鈉、二硝基水楊酸(DNS)、酚酞、亞硫酸、硫酸亞鐵、果膠、水楊酸、DPPH、無水乙醇、HCl、鐵氰化鉀、三氯乙酸、一水合沒食子酸、鄰苯二甲酸氫鉀等 均購自天津科密歐。

UV-2000型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;cp2245型分析天平 Sartorius(德國)公司;恒溫振蕩培養(yǎng)箱 ?，?上海)實驗設(shè)備有限公司;HH恒溫水浴鍋 科偉永興(北京)儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 博迅實業(yè)(上海)有限公司;低溫離心機 中科中佳(安徽)科學(xué)儀器有限公司;pH計 精密科學(xué)儀器(上海)有限公司;R-120型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 BüCHI(瑞士)公司;手持糖度儀 泉州光學(xué)(福建)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 巴氏葡萄球菌TS-82培養(yǎng)液的制備 參照樊明濤[25]等的方法制備發(fā)酵液,具體如下:改良查氏液體培養(yǎng)基:K2HPO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,KCl 0.5 g/L,NaNO33 g/L,蔗糖30 g/L,番茄汁20 g/L,酵母浸粉3 g/L。121 ℃下滅菌20 min后備用。將TS-82菌株接種于上述滅菌培養(yǎng)基中,在37 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長末期,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 釀酒酵母培養(yǎng)液的制備 參照樊明濤[25]等的方法制備發(fā)酵液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 類胡蘿卜素降解酶的制備 類胡蘿卜素降解酶:參照朱明明等[26]的方法制備類胡蘿卜素降解酶酶粉,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 沙棘果酒的釀造

沙棘果汁經(jīng)巴氏殺菌后,冷卻至室溫,添加白砂糖調(diào)節(jié)可溶性固形物(TSS)含量至16%,接著分別采用三種發(fā)酵方式,釀造三種不同類型的沙棘果酒:Ⅰ是添加釀酒酵母(4%)進(jìn)行發(fā)酵,Ⅱ是添加釀酒酵母(4%)和巴氏葡萄球菌(2%)共同進(jìn)行發(fā)酵,Ⅲ是添加釀酒酵母(4%)和類胡蘿卜素降解酶(1%)共同進(jìn)行發(fā)酵。

操作要點:a、采用巴氏殺菌,除去其他雜菌,操作條件為68～70 ℃殺菌30 min;b、釀酒酵母接種時,將1.2.2制備得到的酵母培養(yǎng)液取出,離心后去掉上清,加入少量沙棘果汁,于28 ℃下培養(yǎng)2 h,使酵母適應(yīng)環(huán)境后接入沙棘果汁;c、TS-82菌株接種時,同樣地,將1.2.1所制備的培養(yǎng)液取出,離心后去掉上清,加入少量沙棘果汁,于37 ℃下培養(yǎng)2 h,使TS-82適應(yīng)環(huán)境后接入沙棘果汁;d、添加類胡蘿卜素降解酶時,取1.2.3制備的500 μg/L酶粉加入沙棘果汁;e、主發(fā)酵為15 d。

1.2.5 理化指標(biāo)測定 pH:利用pH計進(jìn)行測定;可溶性固形物:利用手持糖度計進(jìn)行測定;還原糖:利用DNS比色法測定[27];酒精度:參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[28]利用酒精度計進(jìn)行測定;滴定酸:參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[28]利用NaOH中和滴定法測定;微生物指標(biāo):參考GB/T 4789.25-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 酒類檢驗》[29]測定菌落總數(shù),并檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌三種致病菌。

1.2.6 總多酚含量測定 參照Chaovanalikit等[30]的Folin-ciocalteu法,略作修改,測定總多酚的含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和測定:準(zhǔn)確配制100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別稀釋成濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸標(biāo)液。分別取0.5 mL上述濃度的標(biāo)液,加入2.5 mL蒸餾水與之混合,加入0.5 mL Folin-ciocalteu顯色劑和1.5 mL7.5%的碳酸鈉溶液,混合均勻。室溫下避光反應(yīng)2 h后,765 nm下測定吸光度值,并根據(jù)相應(yīng)值繪制得到總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.1208x+0.0021,R2=0.9998。以沒食子酸表示總酚含量,單位為g/L(gallic acid計)。

樣品測定:取0.5 mL樣品溶液,加入2.5 mL蒸餾水與之混合,加入0.5 mL Folin-ciocalteu顯色劑和1.5 mL7.5%的碳酸鈉溶液,混合均勻。室溫下避光反應(yīng)2 h后,765 nm下測定吸光度值。蒸餾水作為空白對照。

1.2.7 總黃酮含量測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用60%乙醇溶解蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)品溶液。分別取標(biāo)品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL,采用上述方法進(jìn)行反應(yīng)后,以60%乙醇為空白對照,500 nm下測定吸光度值,繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.1211x+0.0250,R2=0.9991。以蘆丁表示總黃酮含量,單位為mg/L(rutin計)。

樣品測定:參考中國藥典中NaNO2-Al(NO3)3顯色法測定沙棘果酒中總黃酮含量。具體操作方法如下:取沙棘果酒樣品2.0 mL,60%乙醇3.0 mL,5% NaNO2溶液0.3 mL,混合均勻放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,混合均勻放置6 min,而后,加入4% NaOH水溶液4.0 mL,再加入60%乙醇定容至10 mL后,混合均勻,反應(yīng)15 min后,以空白為對照,于500 nm下測定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

1.2.8 DPPH·清除率測定 參考Barba等[31]的研究方法測定DPPH·自由基清除率。將沙棘果酒樣品稀釋10倍后,取0.2 mL稀釋液,加入1.8 mL蒸餾水,再加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液,室溫下避光反應(yīng)30 min后,以7%乙醇水溶液作為參比,于517 nm下測定其吸光度?？瞻子?%乙醇水溶液代替樣品。依據(jù)如下公式計算:清除率(%)=[1-(Al-A10)/A0]×100%,其中A0:空白吸光值;A1:樣品吸光值;A10:樣品溶液本地的吸光值。

1.2.9 鐵離子還原能力測定 參照Oyalzu[32]的方法測定還原能力。取0.2 mL樣品,依次加入1.0 mL蒸餾水,2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液,2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液?；旌暇鶆蚝笤?0 ℃水浴下保溫20 min,加入1.0 mL 10%的三氯乙酸,充分搖勻后3000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液,再依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,700 nm下測定吸光度值,以蒸餾水為空白對照。

以上所有實驗均為三次平行,取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DPS軟件(Version Rel.6.55,1997)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同釀造方法對沙棘果酒品質(zhì)的影響

2.1.1 不同釀造方法對沙棘果酒發(fā)酵過程中pH變化的影響 采用釀酒酵母傳統(tǒng)釀造方法、巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合釀酒酵母、釀酒酵母發(fā)酵并添加類胡蘿卜素降解酶三種釀造方式發(fā)酵沙棘果酒,其發(fā)酵液pH的變化結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,經(jīng)不同釀造方法處理后,沙棘果酒的pH均有顯著性的下降(p<0.05)。而經(jīng)方法Ⅱ、Ⅲ發(fā)酵得到的沙棘果酒與方法Ⅰ釀造的產(chǎn)品,在酒精發(fā)酵結(jié)束后(15 d)的pH并無明顯變化(p>0.05),均在2.8～2.9的范圍內(nèi),表明添加巴氏葡萄球菌TS-82或類胡蘿卜素降解酶均不會影響釀酒酵母的發(fā)酵過程,對果酒的pH無影響。

圖1 不同沙棘果酒釀造過程中pH的變化

2.1.2 不同釀造方法對沙棘果酒發(fā)酵過程中可溶性固形物(TSS)變化的影響 由圖2可知,經(jīng)不同釀造方法處理后,沙棘果酒的可溶性固形物含量隨著發(fā)酵時間的延長均有顯著性的下降(p<0.05)。同樣,在酒精發(fā)酵結(jié)束時,其他兩種方法處理后較傳統(tǒng)方法所得的可溶性固形物含量無顯著性差異(p>0.05),表明添加巴氏葡萄球菌TS-82或類胡蘿卜素降解酶均不會影響釀酒酵母的發(fā)酵過程,對果酒的可溶性固形物無影響。

圖2 不同沙棘果酒釀造過程中可溶性固形物的變化

2.1.3 不同釀造方法對沙棘果酒其他理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的影響 表1列出了經(jīng)不同釀造方法在酒精發(fā)酵結(jié)束后得到沙棘果酒的其他理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)。從表1中可看出,酒精發(fā)酵結(jié)束后還原糖的含量較沙棘果汁顯著下降(p<0.05),但經(jīng)三種釀造方法所得產(chǎn)品均無明顯差異,殘?zhí)橇糠謩e為1.45、1.66、1.75 g/L,酒精度也都達(dá)到6%vol,表明加入巴氏葡萄球菌TS-82或降解酶均可使沙棘果酒與傳統(tǒng)釀造的產(chǎn)品相一致,達(dá)到干酒的要求(殘?zhí)橇康陀? g/L)。在發(fā)酵結(jié)束時,對滴定酸進(jìn)行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)滴定酸含量較果汁均有所增加(p<0.05),與2.1.1中pH降低相一致。對果酒和果汁中的微生物指標(biāo)也進(jìn)行了相應(yīng)的檢測,結(jié)果表明菌落總數(shù)均小于100 CFU/mL,未檢測到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌。上述結(jié)果說明,添加了巴氏葡萄球菌TS-82或類胡蘿卜素降解酶得到的沙棘果酒的品質(zhì)變化不大,在提高風(fēng)味的同時,確保其適口性和安全性。

表1 沙棘果酒的理化指標(biāo)

2.2 不同釀造方法對沙棘果酒發(fā)酵過程中總多酚含量變化的影響

由圖3可知,經(jīng)不同釀造方法發(fā)酵沙棘果酒的過程中,其總多酚含量呈現(xiàn)出先上升后下降再趨于平緩的趨勢。整體而言,三種果酒均在第8 d總多酚含量達(dá)到最高,三種果酒在發(fā)酵結(jié)束時總多酚含量與沙棘果汁相比均顯著升高(p<0.05),分析原因可能是在釀造初期,果汁中的多酚逐漸釋放,而隨著釀造時間的延長,多酚部分被氧化所造成的。方法Ⅱ所得沙棘果酒的總酚含量(9.3 g/L)較方法Ⅰ的結(jié)果(8.9 g/L)明顯升高(p<0.05),這與之前研究的十種多酚總含量增加[25]的結(jié)果相符。方法Ⅲ所得沙棘果酒總酚含量(8.7 g/L)與傳統(tǒng)方法Ⅰ的結(jié)果(8.9 g/L)無顯著性差異(p>0.05),而低于方法Ⅱ所得總多酚含量,表明巴氏葡萄球菌TS-82對于沙棘果酒釀造過程中多酚的釋放有一定促進(jìn)作用,而類胡蘿卜素降解酶則對多酚的釋放及氧化無顯著影響(p>0.05)。

圖3 不同沙棘果酒釀造過程中總多酚含量的變化

2.3 不同釀造方法對沙棘果酒發(fā)酵過程中總黃酮含量變化的影響

由圖4可知,經(jīng)不同釀造方法發(fā)酵沙棘果酒的過程中,其總黃酮含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。整體而言,三種果酒均在第8 d總黃酮含量達(dá)到最高,與總酚的變化一致(p<0.05)。經(jīng)酒精發(fā)酵結(jié)束后(15 d),三種方法所得沙棘果酒的總黃酮含量無顯著性差異(p>0.05),較沙棘果汁(40 mg/L)均有所降低,但并無顯著性差異(p>0.05),這與之前所做的槲皮素和蘆丁含量有所降低的結(jié)果一致[25],分析原因可能是在沙棘果酒釀造環(huán)境中,相較于其他的多酚類物質(zhì),黃酮類物質(zhì)更容易發(fā)生氧化所致。

圖4 不同沙棘果酒釀造過程中總黃酮含量的變化

2.4 不同釀造方法對沙棘果酒發(fā)酵過程中DPPH·清除率的影響

經(jīng)不同釀造方法所得沙棘果酒的DPPH·清除能力如圖5所示。由圖5可看出,經(jīng)不同釀造方法得到的沙棘果酒與沙棘果汁相比,對DPPH·都有較好的清除能力(p<0.05),表明沙棘果是一類比較強的自由基猝滅劑,分析原因可能是由于其中含有的多酚類化合物具有較強的自由基清除能力。經(jīng)方法Ⅱ所得沙棘果酒的清除DPPH·的能力比傳統(tǒng)方法Ⅰ和方法Ⅲ得到的果酒清除能力都要強(p<0.05),方法Ⅲ和傳統(tǒng)方法Ⅰ得到果酒的清除能力無顯著性差異(p>0.05),這與多酚含量的增加相一致。整體而言,DPPH·清除能力也在第8 d達(dá)到最大,與總酚、總黃酮變化一致。

圖5 不同沙棘果酒釀造過程中DPPH·清除率的變化

2.5 不同釀造方法對沙棘果酒發(fā)酵過程中鐵離子還原能力的影響

圖6是經(jīng)不同釀造方法沙棘果酒還原能力的變化情況。由圖6可知,三個實驗樣品的鐵離子還原能力都呈現(xiàn)出先增強后下降,最后趨于平緩的趨勢。同樣地,在發(fā)酵第8 d,還原能力最大,而且添加巴氏葡萄球菌TS-82菌株的沙棘果酒的還原能力(88%)總體稍高于傳統(tǒng)釀造的(85.2%)(p<0.05),這與前面的結(jié)果相一致。但是添加類胡蘿卜素降解酶的沙棘果酒,其還原能力(87.6%)也高于傳統(tǒng)釀造的(p<0.05),與添加巴氏葡萄球菌TS-82菌株的沙棘果酒的還原能力(88%)無顯著性差異(p>0.05),這與其多酚含量的結(jié)果不太相符,表明鐵離子還原能力并不完全隨多酚含量的增加而增加,而與其中的多酚組成有關(guān)。

圖6 不同沙棘果酒釀造過程中還原能力的變化

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)方法Ⅰ相比,方法Ⅱ、Ⅲ對pH、可溶性固形物、微生物等理化性質(zhì)影響不大,且均無致病菌檢出。應(yīng)用方法Ⅱ,可顯著提高總酚含量(9.3 g/L)(p<0.05),且DPPH·的清除能力(86.5%)和還原能力(88%)也有所提高(p<0.05)。應(yīng)用方法Ⅲ,較傳統(tǒng)方法Ⅰ,沙棘果酒總酚含量(8.7 g/L)和DPPH·的清除能力(84.7%)無顯著性差異(p>0.05),還原能力(87.6%)有所增加(p<0.05);但與方法Ⅱ相比,其沙棘果酒總酚含量和DPPH·的清除能力(84%)均顯著性下降(p<0.05)。因此,綜合理化指標(biāo)和抗氧化性,巴氏葡萄球菌TS-82聯(lián)合酵母菌發(fā)酵的方式應(yīng)用在沙棘果酒釀造中,在改善果酒風(fēng)味的同時,有利于開發(fā)高抗氧化性的保健食品。