王士峰,姚添淇,馮榮虎,胡桂平,勞翠瑜,張世偉

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院,廣東深圳 518102)

近年來,羊奶的營養(yǎng)保健功效正逐漸被人們認識和接受,嬰幼兒配方羊奶粉以營養(yǎng)豐富、不易導(dǎo)致過敏等優(yōu)點受到消費者歡迎,成為我國乳制品中增長最快的產(chǎn)品[1]。因為羊奶產(chǎn)量較低,且受季節(jié)波動影響,配方羊奶粉的價格也普遍高于牛奶。配方奶粉生產(chǎn)過程中常需額外添加乳清粉使各種蛋白比例接近母乳水平,相比牛乳清,市場上羊乳清粉量小價高,故一些廠商在配方羊奶粉中添加牛乳清粉,且沒有進行明確標識,這不僅危及整個行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,而且嚴重威脅牛奶過敏消費者的身體健康[2]。2016年6月8日,國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了《嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品配方注冊管理辦法》,第三十一條規(guī)定,產(chǎn)品名稱中有動物性來源的,應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品配方在配料表中如實標明使用的生乳、乳粉、乳清(蛋白)粉等乳制品原料的動物性來源[3]。而目前卻缺乏相應(yīng)的檢測方法。

牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)由162個氨基酸殘基組成,含5個半胱氨酸,占總?cè)榍宓鞍缀康?0%,占牛奶總蛋白12%左右,可作為牛乳清粉的主要標識物[4]。目前發(fā)表檢測β-lg方法主要包括酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[5-7]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[8]、毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)[9]、表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)[10]、生物傳感器[11-12]等,目前我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1663-2008也可檢測乳球蛋白的含量[13],有廠商亦推出了可檢測β-lg的檢測卡[14]。但以上研究方法主要是將β-lg作為一類過敏原進行檢測,并未對能否檢測其他非牛家畜乳制品中摻入的牛β-lg進行研究。目前可用于檢測羊乳產(chǎn)品中牛β-lg的方法主要是ELISA方法[15-16]。MASIRI等制備了可同時檢測牛酪蛋白和β-lg的膠體金試紙條,anti-酪蛋白與anti-β-lg多抗混合物包被在NC膜上作檢測線1,脫脂奶粉作為檢測線2,該試紙條同時應(yīng)用夾心法和競爭法,對乳清分離蛋白的檢測限(limit of detection,LOD)值為0.01 ppm[17],但是并不能區(qū)分信號來自樣品中的殘留酪蛋白還是乳清蛋白,隨著分析物濃度升高,夾心法信號強度衰減易出現(xiàn)假陰性。

本研究擬針對牛乳清蛋白中主要成分β-lg制備相應(yīng)的單克隆抗體,繼而開發(fā)采用可快速檢測牛β-lg的膠體金競爭免疫試紙條,可方便、快速地對配方羊奶粉中的牛β-lg進行快速檢測,有效維護消費者的合法權(quán)益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛β-lg、α-乳白蛋白(α-Lactalbumin,α-la)、酪蛋白鈉鹽、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、聚乙二醇20000(polyethylene glycol 20000,PEG20000)、雞卵白蛋白(ovalbumin,OVA)、抗體亞類鑒定試劑盒、氯金酸 美國Sigma公司;山羊抗小鼠IgG 美國Arista Biologicals公司;5%堿溶酪蛋白 德國Merck Millipore;PVC膠板、金標墊、吸水紙、樣品墊 上海金標生物科技;硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane,NC膜) 德國Sartorius公司;RIDASCREEN?牛奶蛋白ELISA檢測試劑盒 德國R-Biopharm;BCA蛋白定量試劑盒 湖南艾佳生物科技;脫脂牛奶粉(nonfat skim milk,NFSM) 美國BD公司;生牛乳 深圳晨光乳業(yè);全脂山羊乳粉、山羊乳清粉、脫鹽乳清粉(demineralized whey powder,DWP)、乳清蛋白粉(whey protein powder,WPP) 北安宜品努卡乳業(yè);豆?jié){粉(配料:東北大豆、麥芽糖漿)、杏仁露(配料:杏仁、白砂糖等)、嬰幼兒配方羊奶粉樣本 購自本地超市;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;實驗用水 均為MILLIPORE超純水;除特殊說明,實驗中使用的β-lg、酪蛋白、α-la、NFSM,DWP和WPP均為牛屬性;實驗中使用的全脂山羊乳粉、山羊乳清粉經(jīng)RIDASCREEN?牛奶蛋白ELISA檢測試劑盒檢測,牛奶成分檢測結(jié)果低于最低檢測限(≤0.5%)。

SynergyH1酶標儀 美國Biotek公司;XYZ3060膠體金點樣系統(tǒng) 美國BioDot公司;HGS201可編程切條機 杭州峰航科技;V0200真空干燥箱 德國Memmert公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗體制備及表征 常規(guī)方法建立雜交瘤細胞株[18],牛β-lg作為免疫原,經(jīng)小鼠免疫、細胞融合、篩選能穩(wěn)定分泌β-lg單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)的細胞株。采用動物體內(nèi)生產(chǎn)法制備腹水單抗。抗體腹水收集后采用辛酸硫酸銨聯(lián)合沉淀法純化[19],磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)充分透析,后收集抗體用BCA蛋白定量法測定抗體濃度,使用抗體亞類鑒定試劑盒鑒別抗體亞類。

采用間接ELISA測定抗體效價:用碳酸鹽包被緩沖液(0.05 mol/L,pH9.6)包被抗原(200 ng/孔),用PBS-T溶液(內(nèi)含0.05%Tween20的PBS溶液)倍比稀釋抗體,定義光密度(optical density,OD)值1.0左右的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價,并作為最佳稀釋度。使用間接競爭法確定抗體IC50值:包被條件為200 ng/孔,抗體稀釋度為最佳稀釋度的2倍,配制牛β-lg標準品母液10 mg/mL,再用PBS-T梯度稀釋至100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8 μg/mL,PBS-T做空白對照進行抑制實驗,以β-lg濃度為橫坐標X,OD值為縱坐標Y,利用Origin 8.0建立抗體S形抑制標準曲線,確定抗體IC50值。使用間接競爭法確定抗體特異性,檢測抗體與其他牛奶蛋白及其他常見基質(zhì)蛋白的交叉反應(yīng)率。計算公式為:交叉反應(yīng)率(%)=IC50(β-lg)/IC50(其他分析物)×100。

1.2.2 試紙條制備與表征 膠體金制備采用檸檬酸三鈉還原法。將100 mL的0.01%氯金酸溶液加熱至沸騰,在持續(xù)攪拌下快速加入2.5 mL的1%檸檬酸鈉溶液持續(xù)加熱15 min至顏色不再變化,停止加熱,待溶液恢復(fù)到室溫,用水補齊至原體積,4 ℃保存。確定膠體金標記抗體最適pH、最低抗體標記量[20]。取制備好的膠體金溶液50 mL,用K2CO3調(diào)節(jié)至最適pH,在持續(xù)攪拌下加入1.2倍最低抗體標記量,繼續(xù)攪拌20 min,再加入1/10體積的封閉液(10%BSA,1% PEG20000),再攪拌20 min,10000 r/min離心濃縮后用1/5體積復(fù)溶液(含1%BSA、2%蔗糖、0.05%PEG20000、0.02% NaN3)重懸,4 ℃保存。將金標抗體復(fù)合物以15 μg/cm均勻噴灑到金標墊上,25 ℃真空干燥箱干燥6 h。用PBS溶液稀釋β-lg和山羊抗小鼠IgG至0.3,0.5 mg/mL,以1 μL/cm包被在NC膜上作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線),25 ℃真空干燥1 h。在PVC膠板上依次裝貼樣品墊、金標墊、NC膜和吸水紙,用切條機裁剪成4 mm試紙條[18],真空干燥保存。

試紙條使用方法:將樣品用水適當(dāng)稀釋后,用移液槍吸取40 μL滴加到試紙條樣品墊,5 min后裸眼判定,用水為空白對照。本研究定義可使T線完全消失的樣品濃度或百分比濃度作為試紙條的LOD值。

用水梯度稀釋標準品β-lg母液至500、100、50、10、5、1 μg/mL,水做空白對照,確定試紙條對β-lg的LOD值。選用全脂山羊乳粉、山羊乳清粉、豆?jié){粉、OVA、杏仁露等測試試紙條特異性。固體材料直接用50倍體積的水渦旋振蕩溶解;杏仁露用水5倍稀釋;5% 堿溶酪蛋白用水稀釋至20 mg/mL;配制淀粉溶液時,先配制2%可溶性淀粉溶液,不斷攪拌下迅速煮沸后再微沸3 min,冷卻到室溫備用。每種樣品平行檢測三次。

將制作好的試紙條放入帶干燥劑的密封塑料袋中,分別置于45、37 ℃培養(yǎng)箱和常溫環(huán)境下,于第7、14、21、28 d后取出,滴加水檢測,觀察金標墊金標抗體是否滯留,C/T線出線時間及顏色變化,評價試紙條穩(wěn)定性;選用β-lg梯度稀釋液測試試紙條靈敏度。

1.2.3 摻雜樣品檢測 在全脂山羊乳粉中分別添加不同比例(weight/weight,w/w)的NFSM、DWP和WPP,稱取1 g摻雜樣品,水溶解定容到50 mL。使用試紙條進行檢測,每個樣品平行檢測三次。

1.2.4 配方羊奶粉樣品分析 在本地超市隨機采購不同產(chǎn)地,不同階段的嬰幼兒配方羊奶粉樣本,用水50倍稀釋進行檢測,每個樣品平行檢測三次。同時使用德國R-Biopharm公司牛奶蛋白ELISA試劑盒對奶粉樣本進行檢測,操作方法參見產(chǎn)品說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體表征

由于牛β-lg是牛乳清蛋白的主要成分,故本研究選取β-lg為研究對象。羊乳β-lg和牛一樣,均含有162個氨基酸殘基,兩者氨基酸殘基有6處不同[21]。經(jīng)小鼠免疫,細胞融合、篩選及單克隆化,篩選到一株分泌β-lg mAb的雜交瘤細胞株,命名為1G8。細胞擴大培養(yǎng)制備腹水單抗。β-lg mAb腹水單抗純化后測得抗體濃度為7.2 mg/mL,經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定,抗體屬于IgG2b類抗體。間接ELISA測得抗體效價為1∶10000,抗體IC50值為5.87 μg/mL。β-lg競爭標準曲線見圖1,該抗體與酪蛋白、羊奶等常見基質(zhì)蛋白的交叉反應(yīng)結(jié)果見表1。β-lg mAb和酪蛋白、α-la、全脂山羊乳粉、山羊乳清粉、豆?jié){粉等均未見明顯的交叉反應(yīng),故使用抗體進行后續(xù)免疫層析實驗。

圖1 β-lg間接競爭ELISA標準曲線(n=4)

表1 β-lg mAb與相關(guān)基質(zhì)蛋白的交叉反應(yīng)率

2.2 試紙條敏感性和特異性測試

本研究中制備的免疫層析試紙條基于競爭法,具體結(jié)構(gòu)見圖2(a),金標墊附著金標β-lg mAb,NC膜上包被β-lg、山羊抗小鼠IgG分別作為T線和C線。將樣品溶液滴加到試紙條樣品墊,若樣品中含有β-lg,會率先與金標β-lg mAb結(jié)合,T線抗原被抑制無法顯線,僅顯示C線,即為陽性;若樣品中未含β-lg,金標β-lg mAb與T線抗原結(jié)合顯示T線,與C線二抗結(jié)合顯示C線,即陰性。

圖2 試紙條的靈敏度(a)和特異性(b)測試結(jié)果

用水梯度稀釋標準品β-lg母液,確定試紙條對β-lg的LOD值,結(jié)果見圖2(a)。在0μg/mL時,試紙條顯示兩條帶,當(dāng)標準品濃度為5 μg/mL時,T線抗原被抑制,顏色開始變淺,當(dāng)濃度達到50 μg/mL時,T線完全消失,裸眼幾不可見,故試紙條對β-lg的LOD值為50 μg/mL。液態(tài)牛奶中總蛋白含量約為3.2%,而β-lg占牛奶蛋白12%左右[4],故試紙條對牛奶蛋白的理論LOD值約為420 μg/mL,對液體牛奶的LOD值約為13 mg/mL(即體系中含有1.3%的牛奶)。事實上生牛奶經(jīng)75倍稀釋(相當(dāng)于1.3%的牛奶含量)后,確可消除T線(結(jié)果未展示)。

用試紙條分別對杏仁露、堿溶酪蛋白、淀粉、豆?jié){粉、全脂山羊乳粉等進行檢測,結(jié)果見圖2(b)。杏仁露、淀粉、OVA檢測結(jié)果和空白對照組無明顯區(qū)別,表明這些基質(zhì)成分不會影響試紙條檢測結(jié)果。全脂山羊乳粉、乳清蛋白、豆?jié){蛋白和堿溶酪蛋白組T線相比對照組變淡,可見此濃度全脂山羊乳粉、山羊乳清蛋白、豆?jié){蛋白和堿溶酪蛋白會抑制T線的免疫反應(yīng)。由于實驗中固態(tài)樣品前處理均采用統(tǒng)一的稀釋條件,且僅以消T線作為判定標準,故這些基質(zhì)成分也不會影響試紙條的檢測結(jié)果。

試紙條于不同溫度放置不同時間后,分別滴加水、β-lg標準液進行測試。結(jié)果顯示,陰性實驗C/T線出線時間均在1 min左右,5 min時趨于穩(wěn)定,線型鮮亮如初,無肉眼可辨之異常;β-lg的LOD值均穩(wěn)定在50 μg/mL左右(結(jié)果未展示)。試紙條老化實驗表明,試紙條在4周內(nèi)穩(wěn)定性、靈敏度保持不變。

2.3 摻雜樣本檢測

配方奶粉生產(chǎn)過程中通常不會直接添加β-lg,而是使用DWP、WPP調(diào)節(jié)乳清蛋白含量,所以本研究選擇NFSM、DWP和WPP進行摻雜實驗。本研究中使用的全脂山羊乳粉、NFSM、DWP、WPP粉經(jīng)GB 5009.5-2016第一法凱氏定氮法檢測,總蛋白含量分別為34.2%、34.8%、12.7%和79%;理化特征均滿足相應(yīng)的國標(GB 19644-2010和GB 11674-2010)要求,且經(jīng)SN/T 2051-2008檢測顯示山羊乳粉僅含羊源性成分,NFSM、DWP、WPP均為牛屬性。圖3中,全脂山羊乳粉中分別摻入不同比例的NFSM,DWP和WPP,用免疫層析試紙條進行檢測分析,T線消失時對應(yīng)摻雜百分比濃度,即LOD值分別為5%(圖3a)、5%(圖3b)和0.1%(圖3c)。

圖3 陰性全脂山羊乳粉中添加脫脂奶粉(a)、脫鹽乳清粉(b)和乳清蛋白粉(c)的膠體金免疫層析檢測結(jié)果

由于NFSM、DWP與WPP蛋白含量分別為34.8%、12.7%、79%,若按β-lg占牛奶總蛋白12%,占總?cè)榍宓鞍缀?0%粗略估計[4],NFSM、DWP與WPP的β-lg含量大約為4.2%、6.4%、40%。因為試紙條對β-lg標準品的LOD值為50 μg/mL,故試紙條對NFSM、DWP與WPP的LOD值應(yīng)為1.2、0.78、0.13 mg/mL。因摻雜樣品采用50倍稀釋,即樣品濃度為20 mg/mL,則T線消失對應(yīng)的理論摻雜百分比為6%、3.9%、0.65%?？紤]到樣品純度、β-lg含量波動、稀釋條件等因素,實際結(jié)果和理論檢測限位于同一數(shù)量級,基本吻合。

國標GB 10765-2010規(guī)定乳基嬰兒配方食品中乳清蛋白含量應(yīng)≥60%,而天然牛羊乳中乳清蛋白含量卻不及總蛋白的20%[22],所以配方奶粉生產(chǎn)過程中均需添加大量的DWP或WPP。本方法對羊乳粉中摻雜DWP與WPP的LOD值可達到5%、0.1%,可滿足配方羊奶粉生產(chǎn)過程中摻雜牛乳清蛋白的檢測要求。

2.4 奶粉樣本檢測

將采購的配方羊奶粉樣品編號,用試紙條進行檢測,檢測結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示9個樣品中,除5號和7號,其余7個樣品均顯示陽性,表明這些樣品均有牛奶蛋白成分。同時用牛奶蛋白ELISA試劑盒進行分析,兩種分析方法檢測結(jié)果一致(表2),表明本方法結(jié)果準確可靠。值得注意的是2個陰性樣本,配料表上確實標注“山羊乳清蛋白粉”、“濃縮羊乳清蛋白粉”;而陽性樣本配料表上卻均未表明乳清蛋白的動物來源,只模糊標注“脫鹽乳清粉”、“濃縮乳清蛋白粉”。故陽性樣本中的牛奶蛋白可能來自“脫鹽乳清粉”和 “濃縮乳清蛋白粉”。實際樣品檢測結(jié)果表明,該試紙條可應(yīng)用市售配方羊奶粉的現(xiàn)場快速檢測。

圖4 市售9個配方羊奶粉樣品膠體金免疫層析法檢測結(jié)果

表2 ELISA和膠體金免疫層析法檢測結(jié)果的比較

3 結(jié)論

本研究成功制備了β-lg的單克隆抗體,開發(fā)了可快速檢測β-lg的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條成本低廉,穩(wěn)定性良好,樣品前處理簡單,點樣后5 min后裸眼即可判定結(jié)果,對β-lg的LOD值為50 μg/mL對全脂山羊乳粉中摻雜牛脫脂奶粉、脫鹽乳清粉和乳清蛋白粉的LOD值分別為5%、5%和0.1%。通過對市售配方羊奶粉樣品進行分析,檢測結(jié)果和商品化ELISA試劑盒一致,故本研究開發(fā)的免疫層析試紙條可用于摻雜牛乳清配方羊奶粉的現(xiàn)場快速篩查。