馮國偉 李宏蕾 朱大帥 張艷輝 宋鴿 張振庭 陳明 杜君 姚欣

腎癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居女性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第一位，位居男性第三位［1］。高達(dá)40%患者最終發(fā)生轉(zhuǎn)移［2］，30%患者在初診時被診斷為轉(zhuǎn)移性腎癌。腎癌對化療和放療不敏感，對分子靶向治療反應(yīng)率低，5年生存率＜10%［3］。因此，深入理解腎癌的發(fā)病機(jī)制，尋求新的可靠的腫瘤預(yù)測因子，將為改善早期診治提供重要幫助。研究顯示，趨化因子參與構(gòu)建腫瘤微環(huán)境，并在腫瘤增殖、侵襲、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［4］。新的證據(jù)提示，趨化因子配體5（CXCL5）在膀胱癌［5］、前列腺癌［6］等惡性腫瘤中高表達(dá)，通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。但是，CXCL5在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚，其對于腫瘤進(jìn)展的預(yù)測作用仍有待闡述。本研究通過整理數(shù)據(jù)庫和腎癌患者的臨床病理資料，評價CXCL5在腫瘤中的表達(dá)，考察其表達(dá)水平與臨床分期、病理分級、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的相關(guān)性，旨在闡述CXCL5的表達(dá)與臨床意義的關(guān)系，為腎癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供新的思路和證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 收集2012年11月至2014年6月105例就診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院并行手術(shù)治療的腎癌患者的臨床病理資料，62例組織標(biāo)本中CXCL5表達(dá)的患者作為試驗(yàn)組，選擇正常腎臟和癌旁組織標(biāo)本各20例作為對照組。根據(jù)CXCL5的表達(dá)情況將試驗(yàn)組62例分為低表達(dá)組26例、中表達(dá)組20例、高表達(dá)組16例。采用Fuhrman分級系統(tǒng)進(jìn)行分級，試驗(yàn)組FuhrmanⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ～Ⅳ級組織中CXCL5表達(dá)標(biāo)本各20、20、15例，對照組的正常腎臟、癌旁組織中CXCL5表達(dá)標(biāo)本各3、7例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 兔源抗人CXCL5單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔SP試劑盒購自北京中杉天橋生物技術(shù)有限公司。TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司?？焖贌晒舛縋CR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CbioPortal數(shù)據(jù)庫 整合包括TCGA、ICGC等數(shù)據(jù)庫中126個腫瘤基因組研究。檢索數(shù)據(jù)庫中腎癌患者的CXCL5變異/突變情況，篩選出樣本量較多和信息量較大的研究項目，獲得詳細(xì)的突變結(jié)果。此外，從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出與CXCL5突變相關(guān)的臨床預(yù)后信息（如總生存率、無病生存率以及腫瘤轉(zhuǎn)移等）并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測病理切片中CXCL5的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑說明書進(jìn)行。采用雙盲法，由兩位資深病理醫(yī)師分別閱片評判。在顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野，評估陽性細(xì)胞在整個視野中所占百分比，計算平均值。其中陽性細(xì)胞百分比＜25%為低表達(dá)組，陽性細(xì)胞百分比25%～75%為中表達(dá)組，陽性細(xì)胞百分比＞75%為高表達(dá)組。CXCL5表達(dá)的定量分析根據(jù)陽性區(qū)域在每一個視野中所占面積設(shè)計評分系統(tǒng)：0分（0）、1分（1%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。

1.2.3 實(shí)時定量RT-PCR檢測 研磨腎癌組織樣本，TRIzol法提取總RNA，使用Nanodrop分光光度計進(jìn)行RNA定量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。選取GAPDH作為內(nèi)參，定量分析目的基因mRNA水平。每個樣本3個復(fù)孔，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 隨訪 截至2018年5月，術(shù)后隨訪時間為46～66個月，平均隨訪時間為54.9個月?？傠S訪人數(shù)為105例，失訪人數(shù)為12例。43例不表達(dá)CXCL5和62例表達(dá)CXCL5患者中，有效隨訪人數(shù)分別為40例和53例，死亡人數(shù)分別為11例和14例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖。利用Spearsman和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，利用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于數(shù)據(jù)庫的CXCL5與腎癌預(yù)后相關(guān)性分析

通過檢索CbioPortal數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相較于CXCL5無突變的腎癌患者，CXCL5突變患者的總生存率（圖1A）和無病生存率（圖1B）均明顯縮短（P＜0.05），而其復(fù)發(fā)的比例較高（66.67%vs.29.67%），中位無病生存時間較短（33.38個月vs.108.37個月）。此外，CXCL5 mRNA表達(dá)水平與M分期（圖2A）、T分期（圖2B）以及淋巴結(jié)浸潤（圖2C）有一定相關(guān)性，而且CXCL5的表達(dá)水平還與患者總生存狀態(tài)（圖2D）和生命狀態(tài)（圖2E）有關(guān)。

圖1 CXCL5突變與腎癌患者總生存率和無病生存率的關(guān)系

2.2 CXCL5表達(dá)與腎癌病理分級、臨床分期以及預(yù)后的關(guān)系

在高表達(dá)CXCL5的腎癌組織中，F(xiàn)uhrman高分級（Ⅲ～Ⅳ級）的患者所占比例較大，且在不同F(xiàn)uhrman分級的腎癌組織中CXCL5的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，CXCL5的表達(dá)與腫瘤大小呈正相關(guān)，與此對應(yīng)的CXCL5高表達(dá)組中，T3期患者所占比例較大（P＜0.05，表1）。

不表達(dá)與表達(dá)CXCL5患者的1、2、3和5年生存率分別為96%、92%、87%和79%與93%、85%、76%和65%，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)不表達(dá)和表達(dá)CXCL5患者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3），提示表達(dá)CXCL5的腎癌患者預(yù)后較差。

2.3 腎癌組織中CXCL5的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測對照組的正常腎臟組織中CXCL5表達(dá)率為15.00%（3/20）、癌旁組織中為35.00%（7/20），試驗(yàn)組為59.05%（62/105），組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A）。CXCL5表達(dá)定量分析的評分結(jié)果顯示，對照組的正常腎臟組織中CXCL5表達(dá)為（0.13±0.06）分、癌旁組織中為（0.64±0.32）分，試驗(yàn)組中FuhrmanⅠ級為（0.99±0.40）分、Ⅱ級為（1.57±0.42）分、Ⅲ～Ⅳ級為（2.87±0.46）分，試驗(yàn)組的評分顯著高于對照組（P＜0.05，圖4B）。同時，本研究隨機(jī)選取50例腎癌患者的組織標(biāo)本，檢測CXCL5 mRNA表達(dá)水平，其中39例（78%）上調(diào)表達(dá)、8例（16%）不表達(dá)、3例（6%）下調(diào)表達(dá)（圖5A）。此外，試驗(yàn)組的CXCL5表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.05），且隨Fuhrman分級增加呈現(xiàn)增加趨勢（圖5B）。

圖2 CXCL5表達(dá)水平與腎癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移、分期、陽性淋巴結(jié)數(shù)量及生存的關(guān)系

表1 CXCL5的表達(dá)與62例腎癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖3 CXCL5表達(dá)與腎癌患者生存率的關(guān)系

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測試驗(yàn)組與對照組組織中CXCL5的表達(dá)

圖5 實(shí)時定量RT-PCR檢測CXCL5 mRNA的表達(dá)

3 討論

CXCL5是ELR+CXC類趨化因子，又稱上皮中性粒細(xì)胞活化肽78（ENA78），可由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌，其與CXCR2識別并結(jié)合，趨化腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動，促進(jìn)血管新生，加快腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［7］。有研究顯示，CXCL5在臨床高分期的惡性黑色素瘤中呈高表達(dá)［8］。CXCL5能夠增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而且CXCR2基因敲除細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，CXCL5/CXCR2生物軸能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［9］。同時，在鼻咽癌中也觀察到相似的結(jié)果［10］，揭示該生物軸通過激活ERK/GSK-3β/Snail信號通路促進(jìn)腫瘤的EMT過程。

目前，腎癌組織中CXCL5的表達(dá)及臨床意義尚不清楚。研究顯示，腎癌患者血清中CXCL5的表達(dá)高于健康人群，而且進(jìn)展期患者術(shù)前血清中CXCL5水平高于早期患者［11］。本研究結(jié)果顯示，正常腎臟和癌旁組織中CXCL5不表達(dá)或呈局灶性表達(dá)，而腎癌組織中CXCL5高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤位置、吸煙史和BMI指數(shù)等臨床參數(shù)無關(guān)，但與臨床分期和腫瘤大小相關(guān)，提示CXCL5可能參與腫瘤的生長和增殖。本研究結(jié)果還顯示，不同CXCL5表達(dá)水平的亞組間，未觀察到CXCL5表達(dá)與N分期和M分期的相關(guān)性，但仍不能排除CXCL5在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用。重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)CXCL5的表達(dá)與Fuhrman分級呈正相關(guān)。Fuhrman分級系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的腎癌的核分級系統(tǒng)，也是目前被廣泛認(rèn)同的腎癌預(yù)后判斷的獨(dú)立指標(biāo)之一。Fuhrman分級系統(tǒng)有助于判斷疾病進(jìn)展和預(yù)后、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險［12］，F(xiàn)uhrman分級越高則患者的總生存率和癌癥特定生存率明顯降低。本研究結(jié)果也顯示，CXCL5表達(dá)的患者生存率明顯降低。這些發(fā)現(xiàn)提示CXCL5可能與腎癌的進(jìn)展有關(guān)，并在預(yù)測患者預(yù)后方面具有潛在價值。

CXCL5對腎癌生長和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制仍有待明確。研究顯示，CXCL5/CXCR2生物軸對于腎癌血管新生、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用［13］。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CXCL5能夠趨化骨髓來源抑制性細(xì)胞向腎臟腫瘤歸巢，CXCR2抗體聯(lián)合抗PD-1治療能夠顯著減少腫瘤重量并增加CD4+和CD8+T細(xì)胞的浸潤［14］。在另一項研究中，腎癌細(xì)胞通過分泌CXCL5和IL-8，趨化中性粒細(xì)胞浸潤至肺轉(zhuǎn)移病灶中并發(fā)揮免疫屏障作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長受到抑制［15］，提示CXCL5能夠防止腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。由此可見，趨化因子在腫瘤中的作用復(fù)雜多樣，在不同的時間和空間環(huán)境中表現(xiàn)出較強(qiáng)的異質(zhì)性。因此，需要更多的證據(jù)來揭示CXCL5在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制，對于腫瘤治療新靶點(diǎn)的開發(fā)具有重要價值。

本研究仍存在一定的局限性，首先，研究納入的樣本量相對較小，結(jié)論還需在更大樣本的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證；其次，本研究為回顧性分析，存在一定的偏倚。因此，展望今后的研究方向，期望設(shè)計前瞻性臨床研究，在術(shù)前、術(shù)后以及隨訪中的不同時間點(diǎn)檢測患者血清中CXCL5的表達(dá)水平，考察其與臨床和病理指標(biāo)的關(guān)系，探索其在患者疾病進(jìn)展和預(yù)后評價中的應(yīng)用價值。

綜上所述，結(jié)合數(shù)據(jù)庫和本中心的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CXCL5的表達(dá)與腎癌患者的不良預(yù)后有關(guān)；同時，在腎癌中CXCL5高表達(dá)，其表達(dá)水平與病理分級和臨床分期呈正相關(guān)，CXCL5的表達(dá)預(yù)示著較差的臨床預(yù)后。因此，CXCL5有望成為評估腎癌進(jìn)展和預(yù)后的潛在指標(biāo)，對以靶向CXCL5為基礎(chǔ)的治療策略提供理論基礎(chǔ)和研究思路。