劉勇,孫嘉婧

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針刺介入時機對缺血性中風(fēng)大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b的影響

劉勇1,孫嘉婧2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

觀察不同針刺介入時間對局灶性腦缺血中風(fēng)模型大鼠腦組織細(xì)胞中雙特異性磷酸酶(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和磷酸化糖原合酶激酶-3b(p-GSK3b)的影響。將200只成年雄性SD大鼠隨機分為A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(造模后2 h針刺組)、D組(造模后72 h針刺組)和E組(造模后168 h針刺組),每組40只。除A組外,其余各組均采用線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型。各組術(shù)后1 d、3 d、7 d及14 d分別采用Garcia復(fù)合評分法評定神經(jīng)功能,并采用Western Blot法和RT-PCR法檢測腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。與B組比較,C組和E組在不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)Garcia復(fù)合評分均顯著提高(＜0.01)。D組術(shù)后7 d和14 d Garcia復(fù)合評分與C組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d Garcia復(fù)合評分與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。B組在不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN、p-AKT、p-GSK3b蛋白表達(dá)及PTEN mRNA、p-AKT mRNA、p-GSK3bmRNA表達(dá)與A組和C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組術(shù)后3 d、7 d和14 d PTEN、p-AKT、p-GSK3b蛋白表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組在不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA、p-AKT mRNA、p-GSK3bmRNA表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。針刺可顯著降低缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞中PTEN的表達(dá),顯著升高p-AKT和p-GSK3b的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡,保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)元細(xì)胞,且越早進(jìn)行針刺,效果越好。

針刺;腦梗死;中風(fēng);介入時機;雙特異性磷酸酶;磷酸化蛋白激酶B;磷酸化糖原合酶激酶-3b;大鼠

針刺療法對于腦梗死的臨床治療是積極有效的。大量實驗研究證明,針刺對缺血性中風(fēng)大鼠的治療效果顯著[1]。雙特異性磷酸酶(PTEN)參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞周期[2],其表達(dá)升高可抑制磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表達(dá)[3]。而PI3K/AKT通路是神經(jīng)細(xì)胞再生的重要環(huán)節(jié),磷酸化糖原合酶激酶-3b(p-GSK3b)是PI3K/Akt通路的下游效應(yīng)靶點蛋白,p-GSK3b失活可阻止凋亡通路的激活。抑制PTEN的表達(dá)可促進(jìn)p-AKT和p-GSK3b的表達(dá)[4],從而促進(jìn)受損神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)和再生。本研究通過觀察不同針刺時機對缺血性中風(fēng)大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和GSK3b表達(dá)的影響,為尋找針刺治療腦梗死的最佳時機提供實驗室依據(jù),現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用2月齡、體重為280～300 g的健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠250只(其中50只備用),購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,許可證號(SCXK黑2008004)。將200只大鼠隨機分為A組(假手術(shù)組)、B組(模型組)、C組(缺血2 h針刺組)、D組(缺血72 h針刺組)和E組(缺血168 h針刺組),每組40只。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

電泳槽Mini P-4(Cavoy公司);MultiSkan3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);水平脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司);垂直電泳儀,半干槽,全自動梯度PCR儀、PCR反應(yīng)擴增儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(以色列MiniLumi公司);核酸電泳系統(tǒng)(美國Bio- Rad公司);pH儀(德國Sartorius公司)。

1.2.2 主要試劑

1.2.2.1 WB實驗試劑

蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液、電泳緩沖液、中分子量蛋白marker、NC膜、濕轉(zhuǎn)緩沖液、麗春紅染色液(賽諾博公司提供);蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Roche group);Trizma base、Glycine、T1503、SDS、Sodium deoxycholate (Sigma- Aldrich);山羊抗兔IgG、HRP,山羊抗小鼠IgG、GAPDH鼠單克隆抗體(天德悅公司提供);PTEN、p-AKT和p-GSK3b單抗(美國SANTACRUZ公司)。

1.2.2.2 RT-PCR所用試劑

Goldview染料、50XTAE電泳緩沖液(諾特萊斯生物科技有限公司);2xPCR TaqMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);瓊脂糖(上海貝晶生物技術(shù)有限公司);氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);PCR擴增引物、DNA Marker(2000bp)、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.3 動物模型制備

采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型[5]。將釣魚線經(jīng)75%乙醇消毒后制備線栓,并置于蒸餾水中備用。大鼠成功麻醉后,仰位固定于手術(shù)臺上。手術(shù)區(qū)域常規(guī)消毒,備皮后沿頸前正中線縱行切開皮膚,鈍性分離皮膚和皮下肌肉組織,在暴露左側(cè)頸總動脈(common carotid artery, CCA)后,依次分離出頸外動脈(external carotid artery, ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA),并時刻保護(hù)迷走神經(jīng)。依次在CCA近、遠(yuǎn)心兩端以及ECA掛線備用。隨后先用微動脈夾暫時夾閉ICA,并迅速結(jié)扎CCA近心端和ECA。在距離左側(cè)CCA分叉4 mm處剪一斜向小口,由此將線栓小心插入ICA中,先將CCA遠(yuǎn)端掛線稍系緊,然后繼續(xù)推進(jìn)栓線進(jìn)入ICA,在栓線過ICA的分叉18 mm時,系緊CCA遠(yuǎn)心端的掛線。然后清理手術(shù)切口,用青霉素消炎處理,再逐層縫合肌肉和皮膚,用碘伏對切口表面進(jìn)行局部消毒。A組除不進(jìn)行插入線栓外,其余處理同B組。造模成功大鼠會出現(xiàn)明顯右肢癱瘓;或?qū)⑵涮嵛矐铱諘r,出現(xiàn)右上肢屈曲或向左側(cè)傾斜、轉(zhuǎn)圈。

1.4 動物干預(yù)方法

C組、D組和E組分別在造模成功后2 h、72 h和168 h進(jìn)行針刺治療。取左側(cè)百會及雙側(cè)風(fēng)池穴,穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》[6]。將大鼠牢牢捆綁固定后,采用0.30 mm×13 mm毫針進(jìn)行針刺,百會向曲鬢穴透刺,進(jìn)針約0.8 mm,留針30 min,其間每隔10 min行捻轉(zhuǎn)手法1 min,要求速度為180～200 r/min;風(fēng)池進(jìn)針約0.5 mm,留針30 min,其間每隔10 min行提插捻轉(zhuǎn)手法1次。各針刺組均每日治療1次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能評分測定

各組分別于術(shù)后1 d、3 d、7 d及14 d隨機選擇10只大鼠,采用Garcia 18分的復(fù)合評分法[7]對神經(jīng)功能進(jìn)行評分。

1.5.2 腦組織標(biāo)本采集及指標(biāo)的測定

在神經(jīng)功能評分測試完成后,在相應(yīng)時間將大鼠處死并斷頭,分離缺血部分的腦組織備用。利用WB法檢測PTEN、p-AKT和p-GSK3b蛋白的表達(dá),利用RT-PCR法檢測PTEN、p-AKT和p-GSK3bmRNA的轉(zhuǎn)錄情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用法。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

各組在取材前共死亡45只,未進(jìn)行取材及實驗數(shù)據(jù)分析,總死亡率為18.4%。其中A組死亡1只,原因為進(jìn)行CCA切口時不慎將其剪斷,且近心端未結(jié)扎完全,導(dǎo)致大量出血死亡;B組死亡8只;C組死亡16只;D組死亡11只,E組死亡9只。造模時大鼠共死亡39只,造模成功率為80.9%,死亡原因為術(shù)中損傷迷走神經(jīng)導(dǎo)致呼吸心率衰竭、插入線栓時大量出血及術(shù)后感染等。此外,C組在造模后2 h進(jìn)行針刺治療,由于大鼠掙扎導(dǎo)致未完全愈合的傷口開裂,從而出血或感染死亡5只。進(jìn)行手術(shù)且存活的大鼠均單獨置于實驗動物專用籠,保證供給足量且等量的飼料和水,盡可能保證影響因素一致,并按時清理墊料保持衛(wèi)生,以此避免感染及不必要的傷害。剩余5只大鼠妥善飼養(yǎng)。

2.1 各組不同時間點Garcia復(fù)合評分比較

由表1可見,A組不存在神經(jīng)功能缺損,故4個時間點評分均為(18.00±0.00)分。C組和E組術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d Garcia復(fù)合評分與B組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。D組術(shù)后1 d Garcia復(fù)合評分與B組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。D組術(shù)后7 d和14 d Garcia復(fù)合評分與C組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d Garcia復(fù)合評分與C組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后3 d、14 d Garcia復(fù)合評分與D組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能明顯提高腦缺血中風(fēng)大鼠Garcia復(fù)合評分,改善其感覺、運動和協(xié)調(diào)功能,其中C組改善大鼠神經(jīng)功能效果最好。

表1 各組不同時間點Garcia復(fù)合評分比較 (±s,分)

注:與B組比較1)＜0.01;與C組比較2)＜0.05;與D組比較3)＜0.05

2.2 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b蛋白表達(dá)比較

由圖1、表2可見,A組大鼠腦組織中PTEN蛋白呈低表達(dá);B組大鼠腦組織中PTEN蛋白呈高表達(dá),隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時到達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中PTEN蛋白表達(dá)均有不同程度降低,隨著針刺時間的延長,降低越為顯著,其中以C組最為明顯。

B組、C組、D組和E組在不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN蛋白表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組、D組和E組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN蛋白表達(dá)與B組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。D組和E組術(shù)后3 d、7 d和14 d PTEN蛋白表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。E組術(shù)后14 d PTEN蛋白表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠降低缺血腦組織中PTEN蛋白表達(dá),且針刺干預(yù)越早對PTEN的影響越明顯。

由圖1、表3可見,A組大鼠腦組織中p-AKT蛋白呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-AKT蛋白呈低表達(dá),隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時到達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-AKT蛋白表達(dá)均有不同程度升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

表2 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中PTEN蛋白表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.05;與C組比較4)＜0.05;與D組比較5)＜0.05

表3 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中p-AKT蛋白表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)P＜0.05

B組和C組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d) p-AKT蛋白表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (＜0.01,＜0.05)。C組和D組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT蛋白表達(dá)與B組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組術(shù)后3 d、7 d和14 d p-AKT蛋白表達(dá)與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d p-AKT蛋白表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-AKT蛋白表達(dá),針刺干預(yù)越早對p-AKT影響越明顯。

由圖1、表4可見,A組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白呈低表達(dá),隨缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時到達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白表達(dá)均有不同程度升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

B組、C組和D組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3b蛋白表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。C組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3b蛋白表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d p-GSK3b蛋白表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-GSK3b蛋白表達(dá),針刺干預(yù)越早對p-GSK3b的影響越明顯。

表4 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中p-GSK3b蛋白表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.01,3)＜0.05;與C組比較4)＜0.01,5)＜0.05;與D組比較6)＜0.05

2.3 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b轉(zhuǎn)錄比較

由圖2可見,A組大鼠腦組織中PTEN mRNA呈低轉(zhuǎn)錄;B組大鼠腦組織中PTEN mRNA呈高轉(zhuǎn)錄,隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時達(dá)到高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中PTEN mRNA的轉(zhuǎn)錄情況均有不同程度的降低,隨著針刺時間的延長,降低越為顯著,其中以C組最明顯。

由表5可見,B組、C組、D組和E組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA表達(dá)與A組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后3 d、7 d和14 d PTEN mRNA表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠有效抑制缺血腦組織中PTEN mRNA的轉(zhuǎn)錄,針刺干預(yù)越早對PTEN mRNA的影響越明顯。

由圖3可見,A組大鼠腦組織中p-AKT mRNA呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-AKT mRNA呈低表達(dá),隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-AKT mRNA表達(dá)均有不同程度的升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

由表6可見,B組、D組和E組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT mRNA表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組術(shù)后1 d、7 d和14 d p-AKT mRNA表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。C組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT mRNA表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后7 d和14 d PTEN mRNA表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-AKT mRNA表達(dá),針刺干預(yù)越早對p-AKT mRNA的影響越明顯。

表5 各組大鼠不同時間點腦組織中PTEN mRNA表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術(shù)后1 d;2為A組術(shù)后3 d;3為A組術(shù)后7 d;4為A組術(shù)后14 d;5為B組術(shù)后1 d;6為B組術(shù)后3 d;7為B組術(shù)后7 d;8為B組術(shù)后14 d; 9為C組術(shù)后1 d;10為C組術(shù)后3 d;11為C組術(shù)后7 d;12為C組術(shù)后14 d;13為D組術(shù)后1 d;14為D組術(shù)后3 d;15為D組術(shù)后7 d;16為D組術(shù)后14 d;17為E組術(shù)后1 d;18為E組術(shù)后3 d;19為E組術(shù)后7 d;20為E組術(shù)后14 d

表6 各組大鼠缺血腦組織中p-AKT mRNA表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)＜0.01,8)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術(shù)后1 d;2為A組術(shù)后3 d;3為A組術(shù)后7 d;4為A組術(shù)后14 d;5為B組術(shù)后1 d;6為B組術(shù)后3 d;7為B組術(shù)后7 d;8為B組術(shù)后14 d; 9為C組術(shù)后1 d;10為C組術(shù)后3 d;11為C組術(shù)后7 d;12為C組術(shù)后14 d;13為D組術(shù)后1 d;14為D組術(shù)后3 d;15為D組術(shù)后7 d;16為D組術(shù)后14 d;17為E組術(shù)后1 d;18為E組術(shù)后3 d;19為E組術(shù)后7 d;20為E組術(shù)后14 d

由圖4可見,A組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA呈高表達(dá);B組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA呈低表達(dá),隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時達(dá)高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA表達(dá)均有不同程度的升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

由表7可見,B組、C組、D組和E組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3bmRNA表達(dá)與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。C組不同時間點(術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3bmRNA表達(dá)與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。E組術(shù)后14 d p-GSK3bmRNA表達(dá)與D組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-GSK3bmRNA表達(dá),針刺干預(yù)越早對p-GSK3bmRNA的影響越明顯。

表7 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中p-GSK3b mRNA表達(dá)比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01;與D組比較6)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術(shù)后1 d;2為A組術(shù)后3 d;3為A組術(shù)后7 d;4為A組術(shù)后14 d;5為B組術(shù)后1 d;6為B組術(shù)后3 d;7為B組術(shù)后7 d;8為B組術(shù)后14 d; 9為C組術(shù)后1 d;10為C組術(shù)后3 d;11為C組術(shù)后7 d;12為C組術(shù)后14 d;13為D組術(shù)后1 d;14為D組術(shù)后3 d;15為D組術(shù)后7 d;16為D組術(shù)后14 d;17為E組術(shù)后1 d;18為E組術(shù)后3 d;19為E組術(shù)后7 d;20為E組術(shù)后14 d

3 討論

神經(jīng)功能評分是腦缺血中評價神經(jīng)功能損害及神經(jīng)功能恢復(fù)程度的行為學(xué)檢查方法。目前,Garcia復(fù)合評分法從大鼠自主運動、體態(tài)活動對稱性、前肢伸展功能、網(wǎng)格實驗、身體雙側(cè)感覺、雙側(cè)胡須反射6方面多角度評價神經(jīng)功能缺損程度,可避免單一評價方法的片面及主觀性,且該方法可操作性好[5]。本研究對針刺后的腦缺血中風(fēng)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分,證實針刺能明顯提高腦中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能Garcia復(fù)合評分,改善缺血性中風(fēng)大鼠的感覺、運動和協(xié)調(diào)功能,從而有效改善缺血型腦中風(fēng)大鼠的神經(jīng)功能。

本研究在對于腦缺血模型大鼠的針刺治療中遵循了中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)理論,并結(jié)合現(xiàn)代臨床研究,采用活血化瘀、醒腦開竅的治法,取頭部百會穴(透曲鬢穴)及風(fēng)池穴,此法在頭部貫穿督脈、膀胱經(jīng)、膽經(jīng)3條陽經(jīng),可通發(fā)陽氣,從而達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、行散瘀血的作用。針刺首先對還未凋亡的神經(jīng)細(xì)胞和未受累及的正常神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行雙向刺激,以此來抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞活性;其次,針刺還能改善局部血液循環(huán),提高缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性,這進(jìn)一步加強了腦代償功能,使神經(jīng)細(xì)胞功能迅速得到改善和保護(hù)[7-9]。

PTEN陽性表達(dá)產(chǎn)物具有磷酸酶活性[3],其在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在,尤其在大腦皮質(zhì)、杏仁核、尾殼核、小腦、海馬的表達(dá)較強[10]。腦缺血后,缺血部位細(xì)胞內(nèi)滲透迅速升高,嚴(yán)重打破細(xì)胞內(nèi)外離子平衡,使細(xì)胞水腫、壞死、凋亡,嚴(yán)重情況可直接導(dǎo)致細(xì)胞破裂。由此凋亡的細(xì)胞破裂后,向周圍細(xì)胞釋放化學(xué)信號,使PTEN迅速升高表達(dá)[11],并調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路,通過減少磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3),抑制細(xì)胞增殖,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12-15]。

本實驗結(jié)果表明,缺血腦組織中PTEN蛋白和基因呈高表達(dá),不同針刺介入時機治療后,PTEN蛋白和基因表達(dá)均有不同程度的降低,其中以C組變化最為明顯。神經(jīng)元死亡形式主要有壞死和凋亡兩種,下調(diào)PTEN可阻斷鈣離子內(nèi)流[16],減少鈣離子超載引起的神經(jīng)元延遲性壞死,同時平衡細(xì)胞內(nèi)外離子水平,改善能量代謝,抑制缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡[1]。筆者推測針刺對缺血性中風(fēng)大鼠腦損傷的保護(hù)機制可能是通過誘導(dǎo)PTEN基因表達(dá)下調(diào),從而激活PI3K/Akt信號通路,使p-AKT蛋白表達(dá)增加,抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

近年來相關(guān)研究表明,PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為促進(jìn)細(xì)胞生存關(guān)鍵信號通路已經(jīng)得到廣泛的證實,對維持細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[3]。PI3K/AKT途徑的負(fù)性調(diào)控主要受具有雙重功能的類脂磷酸酶PTEN的調(diào)控,存在p-AKT參與促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的生理活動,尤其在組織缺血和缺氧的條件下,p-AKT的作用則更為重要[18-20]。本實驗結(jié)果表明,不同時間點腦缺血模型組p-AKT蛋白和基因表達(dá)明顯降低,不同針刺介入治療后較腦缺血組明顯增加,且神經(jīng)功能缺損減輕,腦組織病理損害減小,其中以C組最為明顯。不同針刺介入時機是通過PI3K/AKT通路的激活并增加磷酸化AKT的水平發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用。

GSK-3是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶,包括GSK-3a和GSK-3b兩種亞型,其中GSK-3b與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用GSK-3b抑制劑可以保護(hù)腦缺血中神經(jīng)細(xì)胞,減少腦梗死體積并且改善神經(jīng)功能缺失。磷酸化的GSK-3b能夠抑制GSK-3b的活性,參與神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)。有研究報道,缺氧預(yù)處理可以通過增加p-AKT的表達(dá)而增加p-GSK3b的表達(dá),從而對缺氧損傷的神經(jīng)元起到保護(hù)作用[21]。本實驗中B組p-GSK3b蛋白和基因的表達(dá)明顯降低;不同針刺介入時機治療后能明顯增加p-GSK3b蛋白和基因的表達(dá),其中以C組最為明顯。針刺抑制GSK-3b活性可能通過提高體內(nèi)Mg2+濃度直接抑制GSK-3b的活性,同時通過增加AKT的磷酸化間接減少GSK-3b活性。

綜上所述,針刺能抑制缺血性中風(fēng)大鼠PTEN蛋白和基因的表達(dá),增強PI3K/AKT/GSK3b信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),這可以改善其缺血組織的能量代謝,調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),從而起到對腦缺血神經(jīng)元損傷的修復(fù)、再生和保護(hù)作用。而且造模后2 h針刺介入的效果明顯優(yōu)于72 h和168 h,故筆者推測針刺介入時機越早,對腦缺血神經(jīng)元損傷的修復(fù)、再生和保護(hù)作用越明顯。但由于實驗條件和經(jīng)驗限制,故尚不足以證明此推測成立。望廣大學(xué)者繼續(xù)努力研究,尋找出最佳時機。

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Effect of Acupuncture Intervention Time on PTEN, p-AKT and p-GSK3bin Brain Tissues of Rats with Ischemic Stroke

1,-2.

1.,,150040,; 2.,150040,

To investigate the effects of different intervention times on phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10 (PTEN), phosphorylated protein kinase B (p-AKT) and glycogen synthase kinase-3b(p-GSK3b) in brain tissue of rats with ischemic stroke.Two hundred adult male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized to group A (sham operation group ), group B (model group), group C (group of acupuncture at 2 h after modeling), group D (group of acupuncture at 72 h after modeling) and group E (group of acupuncture at 168 h after modeling), with 40 rats in each group. Except group A, the rats of all the other groups were prepared into permanent focal cerebral ischemia model by suture-occluded method. Respectively, 1, 3, 7 and 14 days after surgery, Garcia composite score method was used to evaluate the neural function of the rats. Transcription of PTEN, p-AKT and p-GSK3bgene and the expression of their proteins in brain tissues of rats were examined by Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method.Compared with group B, Garcia composite score increased significantly (＜0.01) at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group C and group E. Garcia composite score at different time points (7 and 14 days after surgery) in group D were significantly different from that in group C (＜0.05). Garcia composite score at different time points (3, 7 and 14 days after surgery) in group E were significantly different from that in group C (＜0.05). The expressions of PTEN, p-AKT and p-GSK3bproteins and the expression of PTEN mRNA, p-AKT mRNA and p-GSK3bmRNA at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group B were significantly different from those in group A and group C (＜0.01,＜0.05). The expressions of PTEN, p-AKT and p-GSK3bproteins at different time points (3, 7 and 14 days after surgery) in group D and group E were significantly different from those in group C (＜0.01,＜0.05). The expressions of PTEN mRNA, p-AKT mRNA and p-GSK3bmRNA at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group D and group E were significantly different from those in group C (＜0.01,＜0.05).Acupuncture can significantlydown-regulate the expression of PTEN in the neurons of ischemic brain tissues, and significantly increase the expressions of p-AKT and p-GSK3b, through which it can suppress neural cell apoptosis, protect and repair the damaged neurons. The sooner the intervention of acupuncture, the better the treatment effect.

Acupuncture; Cerebral infarction; Intervention time; Stroke; Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10; Phosphorylated Protein Kinase B; Glycogen synthase kinase-3b; Rats

1005-0957(2018)09-1068-08

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.09.1068

2018-04-18

黑龍江省自然科學(xué)基金項目(H2016061);黑龍江省博士后資助項目(LBH-Z11011)

劉勇(1975—),女,副主任醫(yī)師,博士,Email:24680190@qq.com