李佳宸 史雅文 朱華,2 張希龍 殷敏 程雷

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea，OSA）是以夜間反復(fù)發(fā)生上呼吸道狹窄或坍塌為特征的一種睡眠相關(guān)疾病，它直接導(dǎo)致通氣減少或呼吸暫停，血氧飽和度下降以及睡眠破碎[1]，繼而引發(fā)心腦血管等全身多系統(tǒng)的一系列疾病。覺醒狀態(tài)下上氣道的最小口徑位于口咽部，而OSA患者的上呼吸道口咽部更狹小[2，3]，而口咽部氣道的開放依賴于上氣道擴(kuò)張肌的有效收縮。頦舌肌是其中最大也是最主要的擴(kuò)張肌[4]。健康人群睡眠時(shí)頦舌肌活性具有下降趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在OSA患者中更為明顯[6]，而在覺醒期OSA患者頦舌肌的活性較正常人顯著地增加[5]，這可能是對(duì)上氣道狹窄的一種代償機(jī)制。頦舌肌等上呼吸道肌群的活動(dòng)受舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（HMNs）支配，后者在維持氣道通暢性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。HMNs活性降低會(huì)導(dǎo)致咽肌張力減弱，氣道阻力增加從而導(dǎo)致上呼吸道閉合。因此，HMNs對(duì)于保持上呼吸道開放至關(guān)重要。舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受一系列神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)的調(diào)控，如組胺、去甲腎上腺素、5羥色胺等激動(dòng)性神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)，甘氨酸、γ氨基丁酸等抑制性神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)[7]。我們的前期研究表明，5-HT在HMNs的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，尤其在慢性間歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）環(huán)境下，5-HT受體在舌下神經(jīng)核腹側(cè)核團(tuán)的表達(dá)增高，提示在OAS的發(fā)生發(fā)展中，可能發(fā)揮重要的代償功能[8]。

另一方面，硫化氫（H2S）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控中的作用被逐漸關(guān)注。生理濃度的H2S具有多種生理學(xué)功能，它被認(rèn)為是繼CO、NO之后的另一種新型氣體信號(hào)分子[9]，在機(jī)體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的H2S主要是以L-半胱氨酸為基質(zhì)，分別由胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶 (cystathionine-γlyase,CSE)、3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶 (3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3MST)催化合成H2S。CBS和3MST主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[10，11]，而CSE主要表達(dá)在血管壁組織及心肌組織中[12]。H2S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[13]，所以它被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要神經(jīng)調(diào)節(jié)保護(hù)氣體分子。

研究提示H2S參與延髓呼吸中樞的調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。Hu等[14]在向鼠腦延髓切片中灌注NaHS（外源性H2S供體）后發(fā)現(xiàn)舌下神經(jīng)根分支電位明顯提高，而在灌注CBS抑制劑后電位又下降，提示CBS-H2S參與大鼠中樞節(jié)律性呼吸的調(diào)節(jié)。同時(shí)，H2S還可能參與缺氧條件下對(duì)延髓呼吸中樞的保護(hù)過程，Pan等[15]將延髓切片置于5%氧濃度的環(huán)境中10min后，舌下神經(jīng)根分支電位明顯下降，而用NaHS灌注后其電位再次提高，硫化氫對(duì)呼吸活動(dòng)產(chǎn)生興奮作用，逆轉(zhuǎn)由缺氧引起的呼吸電位抑制作用。Donatti等[16]通過向鼠腦延髓包欽格復(fù)合體內(nèi)微注射CBS抑制劑和NaHS，發(fā)現(xiàn)CBS-H2S可以抑制急性缺氧誘導(dǎo)的肺過度換氣。同樣的，Li等[17]發(fā)現(xiàn)通過向大鼠腦室內(nèi)注射NaHS或L-半胱氨酸（LCys，H2S底物）可以防止急性缺氧大鼠發(fā)生呼吸抑制作用。這些都提示H2S可能會(huì)保護(hù)髓質(zhì)呼吸中樞免受急性缺氧引起的損傷。由于延髓包括較多核團(tuán)，同時(shí)這些研究是針對(duì)急性缺氧而并非針對(duì)CIH。因此，CIH環(huán)境下，H2S對(duì)舌下神經(jīng)核團(tuán)究竟是否發(fā)揮保護(hù)性作用，H2S究竟是否參與缺氧時(shí)舌下神經(jīng)核的調(diào)節(jié)，目前尚無研究討論。因此，我們研究大鼠舌下神經(jīng)核中H2S合成酶在CIH條件下的表達(dá)變化，從而探討H2S參與OSA上呼吸道肌群調(diào)控的可能機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng)物和造模

取12只8周齡的健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量180～200g，由江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按照實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分為間歇性低氧組（CIH組）和常氧對(duì)照組（Control組）。8:30將CIH組大鼠放入低氧箱中，通過周期性通入氮?dú)夂涂諝馐沟脱跸渲械难鯘舛仍?%～21%之間循環(huán)，每一循環(huán)2min，前60S通入氮?dú)馐沟脱跸渲醒鯘舛戎饾u下降至5%，后60S通入空氣使箱內(nèi)氧濃度逐漸恢復(fù)至21%。16:30將箱內(nèi)大鼠取出，放回常氧室內(nèi)飼養(yǎng)。此循環(huán)每天持續(xù)8小時(shí)，連續(xù)35天。對(duì)照組置于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)。兩組大鼠自由攝食、進(jìn)水，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中。

2 RT-PCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)取材

將12只大鼠（每組各6只）以2%戊巴比妥鈉（4mg/100g）麻醉后立即斷頭，快速將腦干分離，根據(jù)Yu[18]的方法將左右兩側(cè)舌下神經(jīng)核組織分離出。根據(jù)Paxinos and Watson[19]圖譜選取舌下神經(jīng)核所在的橫斷面，用微穿刺針提取舌下神經(jīng)核組織，立即置入液氮中，存放于-80度冰箱中。整個(gè)提取操作都在冰上完成。

3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及免疫印跡試驗(yàn)

3.1 RT-PCR

采用β-actin作為內(nèi)參通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）測(cè)定3MST,CBS and CSE mRNA的表達(dá)量。將從舌下神經(jīng)核組織中提取的RNA樣本通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度。檢測(cè)結(jié)果提示OD260/OD280比值在1.8～2.0之間時(shí)，RNA的質(zhì)量符合要求。將提取的RNA配置成20μl反轉(zhuǎn)錄體系，置于37℃水浴鍋1h，再置于72℃水浴鍋10min，冷卻后用于在八排管中配制20μl的反應(yīng)體系。3MST上游引物：5’-CGGCGCTTCCAGGTAGTG-3’，下游引物：5’-CTGGTCAGGAATTCAGTGAATGG-3’；CBS 上游引物：5’-CTCCGGGAGAAGGGTTTTGA-3’，下游引物 ：5’-CATGTTCCCGAGAGTCACCAT-3’；CSE 上游引物：5’-GCTGAGAGCCTGGGAGGATA-3’，下游引 物 ：5’-TCACTGATCCCGAGGGTAGCT-3’；β -actin 上游引物：5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCTT-3’，下游引物：5’-TATCGTCATCCATGGCGAACT-3’。擴(kuò)增反應(yīng)采用35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)具體如下：95℃變性持續(xù)15秒，60℃退火持續(xù)30秒，72℃延伸持續(xù)30秒。PCR結(jié)束后行數(shù)據(jù)分析，循環(huán)閾值（Ct值）取平均值，利用待測(cè)樣品的Ct差值，通過計(jì)算公式2-ΔΔCt法求得相對(duì)值即為該基因在該樣本中的相對(duì)表達(dá)量。

3.2 Western blot

采用GAPDH作為內(nèi)參通過蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)測(cè)定3MST和CBS蛋白的表達(dá)量。以1:100的比例向預(yù)冷的RIPA裂解液中加入混合蛋白酶抑制劑cocktail，充分混勻后，冰上靜置。每5mg組織中加入300ul蛋白裂解液，充分混勻，超聲破碎后冰上靜置10min。4℃12,000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清即可得蛋白樣品，采用CBA法測(cè)量蛋白樣品的濃度。以1∶4的比例向蛋白樣中加入蛋白上樣緩沖液，混勻后100℃水浴鍋中煮沸5分鐘。使用12.5%SDS-PAGE凝膠，每樣孔中加入20ug蛋白樣，先在60V電壓下上分離60分鐘，再在120V下分離40～60分鐘。將SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（Bio-Rad laboratories，F(xiàn)lorida，USA） 在 300mA 下轉(zhuǎn)膜80分鐘。室溫條件下5%脫脂牛奶震蕩孵育2小時(shí)。將條帶放入抗 MPST（1:100,ab85377）；抗 CBS（1∶5000，ab140600）中，4℃搖床孵育過夜。取出條帶，室溫下TBST震蕩洗滌三次，每次10分鐘。室溫條件下將條帶放入二抗（山羊抗兔抗體，1∶5000，CST，USA）中，震蕩孵育1.5小時(shí)。取出條帶，室溫下TBST震蕩洗滌三次，每次10分鐘。隨后曝光。避光條件下配制ECL-plus顯影液，混勻后，均勻滴在PVDF膜上，使用Bio-Rad ChemiDoc凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用ImageJ圖像分析軟件采集灰度值，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 舌下神經(jīng)核中H2S三種合成酶（3MST，CBS，CSE）的mRNA表達(dá)量

通過RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)三種合成酶在舌下神經(jīng)核均有表達(dá)。在CIH條件下，3MST和CBS合成酶mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），而CSE mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，圖 1）。

*：與 Control組相比 P＜0.05；**：與 Control組相比 P＜0.01

2 舌下神經(jīng)核中3MST和CBS蛋白的表達(dá)量

利用Western-blot技術(shù)來檢測(cè)舌下神經(jīng)核中3MST和CBS蛋白的表達(dá)。在CIH組，舌下神經(jīng)核中3MST和CBS蛋白的表達(dá)量均低于對(duì)照組（P<0.05，圖 2）。

圖2舌下神經(jīng)核中3MST和CBS蛋白的表達(dá)量

討論

初步研究結(jié)果顯示，H2S的3種合成酶在舌下神經(jīng)核中都有表達(dá)，但CIH組3MST和CBS在舌下神經(jīng)核中的表達(dá)明顯下調(diào)。

H2S作為一種新型的體內(nèi)氣體信號(hào)分子，近些年它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用已逐步受到關(guān)注，如管理腦中突觸的活動(dòng)[20]，通過下丘腦-垂體-腎上腺軸來調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌[21]。內(nèi)源性H2S在腦中的濃度達(dá)到50～160um，遠(yuǎn)高于它在血清中的濃度（＜46um）[22]。生理濃度的H2S參與呼吸活動(dòng)的調(diào)節(jié)，H2S可以通過提高cAMP水平使延髓呼吸中樞興奮[14]。在急性缺氧狀態(tài)下，H2S可以通過激活KATP通道，抗氧化以及下調(diào)C-fos等途徑保護(hù)呼吸中樞[15]，內(nèi)源性和外源性的H2S都能減少缺氧對(duì)延髓呼吸中樞造成的損傷[23]。TalaeiF等[24]也發(fā)現(xiàn)通過CBS/H2S途徑可以減少缺血再灌注對(duì)組織造成的損傷。但這些研究主要是在鼠腦的延髓水平開展，而延髓中包含舌下神經(jīng)核、疑核、面神經(jīng)核、包欽格復(fù)合體等眾多區(qū)域，H2S是否在缺氧時(shí)對(duì)其中具體每個(gè)核團(tuán)都發(fā)揮保護(hù)作用，目前尚無明確定論。

既往文獻(xiàn)提示，H2S對(duì)多種組織在急性缺氧時(shí)提供了保護(hù)性作用。而OSA的病理生理特征是慢性間歇性缺氧，而CIH對(duì)腦組織所造成的傷害是與持續(xù)性缺氧或者急性缺氧不同的[25]。因此，舌下神經(jīng)核作為一個(gè)與OSA發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的核團(tuán)，在處于CIH條件下時(shí)，H2S究竟對(duì)其發(fā)揮著什么樣的作用，值得我們關(guān)注。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)CIH條件下舌下神經(jīng)核中3MST和CBS mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯降低，推測(cè)H2S的合成減少，舌下神經(jīng)運(yùn)動(dòng)元在缺氧時(shí)受到的保護(hù)作用因此減弱導(dǎo)致其受損加重。在相關(guān)研究中，Li等[26]通過測(cè)定大鼠延髓中H2S濃度、3MST mRNA及3MST蛋白發(fā)現(xiàn)CIH導(dǎo)致大鼠延髓各核團(tuán)中3MST和H2S的表達(dá)均提高，這與我們的研究結(jié)果相反。我們推測(cè)這一結(jié)果可能與CIH程度和時(shí)間有關(guān)，在Li等[26]的研究中，每天6小時(shí)CIH環(huán)境并持續(xù)了14天，而我們的研究中每天8小時(shí)CIH持續(xù)了35天。相對(duì)而言，Li的研究中CIH造成損傷可能處于一個(gè)相對(duì)代償?shù)臓顟B(tài)，所以H2S相關(guān)合成酶的表達(dá)是增加的。而我們的研究中CIH程度更重，可能使組織損傷到了失代償狀態(tài)，因此它的表達(dá)出現(xiàn)減少的趨勢(shì)。對(duì)舌下神經(jīng)核而言，何種程度CIH造成的損傷可被完全代償，進(jìn)而對(duì)整體而言，何種程度OSA引起的損傷是機(jī)體失代償?shù)拈_始，值得基礎(chǔ)和臨床研究的關(guān)注。由于目前相關(guān)文獻(xiàn)較少，針對(duì)這一現(xiàn)象及推測(cè)，尚且需要進(jìn)一步研究的證實(shí)。

以慢性間歇性缺氧為特征的OSA會(huì)使舌下神經(jīng)核中H2S的調(diào)節(jié)逐漸失代償，H2S的表達(dá)量下降，對(duì)舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用減弱，舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性降低，對(duì)口咽部擴(kuò)張肌的調(diào)控作用減弱進(jìn)而引起上氣道狹窄。這可能是加重OSA的發(fā)病機(jī)制之一。我們猜測(cè)H2S對(duì)舌下神經(jīng)核的保護(hù)機(jī)制可能與其抗氧化、抗凋亡作用相關(guān)[17]，這有待在今后的研究中進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

文獻(xiàn)報(bào)道，H2S在OSA這種疾病中也并非完全發(fā)揮正向積極的作用。H2S可以刺激頸動(dòng)脈體感覺神經(jīng)，從而啟動(dòng)頸動(dòng)脈體化學(xué)感受器，使其處于興奮敏感狀態(tài)。臨床研究表明，頸動(dòng)脈體化學(xué)反射的過度活動(dòng)是OSA的一種重要驅(qū)動(dòng)因素[27]。Peng等[28]發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓（SH）大鼠中，CSE-H2S驅(qū)使頸動(dòng)脈體化學(xué)感受器興奮從而會(huì)導(dǎo)致睡眠呼吸暫停，當(dāng)對(duì)其使用CSE抑制劑后，大鼠呼吸情況變的平穩(wěn)，OSA緩解。我們認(rèn)為，這主要因?yàn)镠2S通過CSE發(fā)揮了作用，而后者主要表達(dá)于心血管系統(tǒng)中[12]。盡管在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CBS與3MST占主導(dǎo)地位[10，11]，但外周H2S發(fā)射通路的存在，并且后者可能通過頸動(dòng)脈體化學(xué)感受器發(fā)射來調(diào)控呼吸，這提示我們?cè)趯淼难芯恐?，更要考慮到這外周與中樞H2S催化合成通路中可能存在的交互影響。

本研究發(fā)現(xiàn)硫化氫的3種合成酶均存在于成年大鼠的舌下神經(jīng)核中，并且CIH明顯抑制了3MST和CBS在其中的表達(dá)。這一結(jié)果提示，CBS與3MST-H2S通路可能參與調(diào)節(jié)舌下神經(jīng)核相關(guān)的呼吸活動(dòng)。但這一作用是否與CIH程度和作用時(shí)間存在潛在相關(guān)，同時(shí)是否與外周H2S合成通路有一定交互作用，尚且需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。