劉杰民，張瑜，古娟，鐘日君，王敏，趙琦，藺曉源

(1.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹痛腹瀉、黏液膿血便、里急后重等為主要臨床表現(xiàn)的非特異性腸道炎癥性疾病[1]。目前UC尚無(wú)根治的療法，且易反復(fù)發(fā)作，治愈難度極大，給患者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重傷害。雖然UC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但免疫因素是其公認(rèn)的致病機(jī)制。CD40分子是免疫應(yīng)答中重要的共刺激分子，在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮積極作用，其表達(dá)異常在UC的發(fā)病中被證實(shí)起重要作用[2]。董菲洛教授(貴州省名老中醫(yī))臨床使用健脾益腸散治療UC效果顯著，本研究通過(guò)觀察該臨床經(jīng)驗(yàn)方對(duì)UC模型大鼠CD40蛋白和mRNA表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步明確其治療UC的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，購(gòu)于重慶騰鑫華阜實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0011，體質(zhì)量(200±20)g。

1.2 藥物

健脾益腸散所用藥材(黃芪、太子參、焦白術(shù)、白豆蔻、木香、敗醬草、茯苓、芡實(shí)、補(bǔ)骨脂、炙甘草)均購(gòu)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥藥房，經(jīng)鑒定符合2015年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，按傳統(tǒng)方法煎煮、過(guò)濾、合并濾液，濃縮制成生藥含量分別為15 g/mL，10 g/mL，5 g/mL的高、中、低劑量組藥液，置于4℃冰箱儲(chǔ)藏。柳氮磺吡啶腸溶片(上海福達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020840)；用超純水配制成濃度為0.022 1 g/mL的藥液置于4℃冰箱儲(chǔ)藏。

1.3 主要試劑與儀器

2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma)；CD40兔抗多克隆抗體(abcam)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)；PCR試劑盒(KAPA Biosystems)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Bioswamp)；蛋白質(zhì)Marker(Thermo)。

RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó),Leica)；BX51顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)(日本,Olympus)；Realplex2型熒光定量PCR儀(德國(guó),艾本德)；Bio-Rad蛋白印記系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó),伯樂(lè))；Z32HK高速冷凍離心機(jī)(德國(guó),Hermle)。

1.4 分組與造模

將60只大鼠按體質(zhì)量用計(jì)算機(jī)EXCEL表隨機(jī)數(shù)字法分為空白組,模型組,西藥組和健脾益腸散高、中、低劑量組6組;每組10只。參考文獻(xiàn)方法[3]制備UC大鼠模型：10%水合氯醛(3 mL/kg)注射麻醉，用大鼠灌胃針插入肛內(nèi)8 cm 處，以4 mL/kg劑量注入TNBS溶液(5%TNBS與50%乙醇以1∶1體積配制) 后，提尾倒立5 min?？瞻捉M大鼠注入等劑量的生理鹽水。

1.5 給藥

除空白組外，其余各組自造模第3天開始，按照13.6 mL/kg體積量灌胃，連續(xù)21 d。模型組給予蒸餾水；西藥組給予柳氮磺吡啶腸溶片溶液(0.3 g/kg，成人臨床等效劑量)，中藥高、中、低劑量組分別給予不同濃度(204 g/kg，136 g/kg，68 g/kg，相當(dāng)于成人臨床等效劑量的15，10，5倍)的健脾益腸散濃縮藥液。

1.6 取材

所有大鼠在最后一次給藥后予以水合氯醛溶液麻醉，置冰盒上迅速打開腹腔，取出末端結(jié)腸(距離肛門10 cm長(zhǎng))，剪取一小段置于凍存管放入液氮中速凍，然后-80℃冰箱保存，另一小段放入4%多聚甲醛溶液中固定保存。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸CD40的陽(yáng)性表達(dá)

從4%多聚甲醛中取出結(jié)腸組織標(biāo)本，依次洗滌、脫水、透明、浸蠟，包埋切片；二甲苯浸泡脫蠟，水化，抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷；一抗用CD40兔抗多克隆抗體，滴加二抗，濕盒孵育，DAB染色，蘇木素復(fù)染；二甲苯透明、中性樹膠封片。先在低倍鏡下找到組織，并拍攝200倍圖像，再選取400倍鏡下陽(yáng)性表達(dá)不重復(fù)的5個(gè)視野，使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行CD40陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的平均OD值分析，其值與CD40陽(yáng)性表達(dá)成正比。

1.7.2 Western blot法檢測(cè)結(jié)腸CD40的蛋白表達(dá)

將標(biāo)本從冰箱中取出，加入裂解液提取蛋白、酶標(biāo)法蛋白定量，制備下層分離膠和上層濃縮膠，每孔上樣10 μg蛋白，電泳(濃縮膠80 V 40 min，分離膠 120 V 50 min)、濕轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗(CD40兔抗多克隆抗體) 、二抗孵育，顯色后將膜置于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中檢測(cè)，以目的條帶和GAPDH條帶的灰度比值作為CD40蛋白的表達(dá)水平。

1.7.3 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸CD40的mRNA表達(dá)

將標(biāo)本從冰箱中取出，根據(jù)RT-PCR的SOP依次進(jìn)行組織總RNA的提取、cDNA 第一條鏈的合成和PCR擴(kuò)增。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。CD40-F：ATGGAGATGGCCACTGAGAC，CD40-R：CCGGGACTTTAAACCACAGA，擴(kuò)增片段大小180 bp；GAPDH-F：CAAGTTCAACGGCACAG，GAPDH-R：CCAGTAGACTCCACGACAT，擴(kuò)增片段大小138 bp。每個(gè)樣本CD40基因與GAPDH基因的相對(duì)表達(dá)量采用儀器自帶軟件分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 健脾益腸散對(duì)結(jié)腸組織CD40陽(yáng)性表達(dá)的影響

CD40蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要分布于結(jié)腸黏膜細(xì)胞的胞膜和胞漿，呈棕黃色顆粒染色。模型組CD40的陽(yáng)性表達(dá)較空白組顯著增多(P<0.01)；各給藥組均可不同程度地降低CD40的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；且健脾益腸散高劑量組優(yōu)于其他給藥組(P<0.05)，而其中、低劑量組與西藥組比較差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組結(jié)腸CD40陽(yáng)性表達(dá)比較

注：與空白組比較，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與高劑量組比較，＊P<0.05

圖1 各組結(jié)腸CD40的陽(yáng)性表達(dá)(DAB染色， 200×)

2.2 健脾益腸散對(duì)結(jié)腸組織CD40蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

與空白組比較，模型組CD40蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組均可減少CD40的蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且以中藥高劑量組作用最優(yōu)(P<0.01)，而其低劑量組不及西藥組(P<0.05)，但中劑量組與西藥組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組結(jié)腸CD40蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與高劑量組比較，★P<0.01；與西藥組比較，＊P<0.05

圖2 各組結(jié)腸CD40蛋白免疫印跡電泳圖

2.3 健脾益腸散對(duì)結(jié)腸組織CD40 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組CD40 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組均能降低CD40的mRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且健脾益腸散高劑量組優(yōu)于其低劑量組和西藥組(P<0.05)，而中、低劑量組與西藥組比較差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組結(jié)腸CD40 mRNA表達(dá)比較

注：與空白組比較，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與高劑量組比較，＊P<0.05

3 討論

機(jī)體正常的免疫應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜的、多種成分參與的生理過(guò)程, 樹突狀細(xì)胞(DC)作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，其功能狀態(tài)在腸黏膜 T 細(xì)胞功能性亞群分化和免疫耐受維持過(guò)程中起關(guān)鍵作用。DC激活是導(dǎo)致UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵啟動(dòng)子，而DC功能紊亂是UC發(fā)病的主要原因[4]。DC的活化有賴CD40與其配體(CD40L)的結(jié)合, 從而對(duì)不同時(shí)相的細(xì)胞免疫應(yīng)答起重要控制作用。未成熟的小鼠髓系DC低表達(dá)CD40分子，而經(jīng)LPS刺激成熟的DC高表達(dá) CD40分子，誘導(dǎo)抗原提呈功能亢進(jìn)，引起炎癥因子釋放，進(jìn)而加重腸黏膜炎癥和免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致UC反復(fù)發(fā)作[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，CD40在UC患者結(jié)腸黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，且隨病情的嚴(yán)重程度而升高[6]。UC大鼠存在CD40-CD40L的表達(dá)異常與免疫功能紊亂關(guān)系密切[7]。UC模型小鼠外周血細(xì)胞 CD40 分子表達(dá)較正常小鼠明顯偏高，四神丸有效緩解其結(jié)腸損傷與調(diào)節(jié)外周血CD40/CD40L信號(hào)有關(guān)[8]；清腸化濕方治療UC的作用與有效降低 DC表面抗原 CD40共刺激分子的表達(dá)相關(guān)[5]；雷公藤多苷則與調(diào)節(jié)CD40/CD40L表達(dá)水平，抑制促炎因子、升高抗炎因子以緩解UC結(jié)腸黏膜損傷相關(guān)[9]。此外，Jiang X等[10]研究表明，丹酚酸B鎂治療結(jié)腸炎的作用也與調(diào)節(jié)CD40的表達(dá)有關(guān)；丹參多酚酸鹽可通過(guò)抑制CD40/CD40炎癥通路達(dá)到治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用[11]。因此，CD40分子的表達(dá)異常在炎癥性腸病的發(fā)病中起重要作用。

UC可歸屬于中醫(yī)“泄瀉”“痢疾”等的范疇[12]。董教授認(rèn)為其總屬本虛標(biāo)實(shí)之證，以氣滯、濕熱、血瘀為標(biāo)，以脾氣虧虛為本。若飲食失節(jié)，脾胃不顧，則脾氣虛弱，氣虛無(wú)以御邪，邪蕩腸間，終致氣滯、濕熱、血瘀諸邪雜合，蝕膜潰腸化膿為瘍。病程日久，則更易傷及先天腎元而病纏綿難愈[13-14]。所以治療宜扶正祛邪、標(biāo)本同治。健脾益腸散君用黃芪,臣用太子參、焦白術(shù)重在健脾益氣，助衛(wèi)御邪，平衡免疫；臣用白豆蔻化濕行氣，木香健脾行氣止痛，敗醬草清熱消癰、活血行瘀；佐以茯苓健脾滲濕，芡實(shí)、補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯脾；使以甘草補(bǔ)脾益氣，緩急止痛，調(diào)和諸藥[15]。課題組前期研究證實(shí),該方發(fā)揮療效的作用機(jī)制與調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)途徑指標(biāo)、糾正UC異常的免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)。課題組最新研究表明，健脾益腸散還可能通過(guò)調(diào)節(jié) HSP70、ICAM-1的表達(dá)而達(dá)到對(duì)UC大鼠腸黏膜的免疫保護(hù)[16-17]。

本研究結(jié)果顯示， UC模型大鼠結(jié)腸組織CD40的蛋白和mRNA 表達(dá)均較正常大鼠明顯增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。健脾益腸散高、中、低劑量均可不同程度的降低UC大鼠結(jié)腸黏膜的CD40蛋白和mRNA表達(dá)，且以高劑量效果最為顯著，并優(yōu)于西藥柳氮磺吡啶，但其中劑量與西藥比較差異不顯著。以上結(jié)果表明，健脾益腸散可下調(diào)TNBS誘導(dǎo)的UC模型大鼠結(jié)腸中CD40的表達(dá)，且藥物劑量與其作用之間存在一定的量效關(guān)系。由此本研究進(jìn)一步明確了健脾益腸散可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD40分子水平，降低CD40的蛋白和mRNA表達(dá)，起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而減輕結(jié)腸黏膜免疫損傷來(lái)發(fā)揮治療UC的作用。