宋藝君，郭濤，孫婧，王志彥，李積秀

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.解放軍第451醫(yī)院，陜西 西安 710054)

中藥材生產(chǎn)中有產(chǎn)地加工和炮制兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。產(chǎn)地加工方法通常有凈制、干燥等，有些藥材需通過蒸、煮等方法來處理。中藥炮制有凈制、軟化、切制、干燥、炮制等工序，同樣也有蒸煮等加熱炮制手段。中藥材從產(chǎn)地加工到炮制，經(jīng)過反復(fù)加工處理，勢(shì)必會(huì)影響有效成分的含量。近年來，有專家提出“中藥材產(chǎn)地加工與炮制一體化”，國(guó)家中醫(yī)藥管理局也專門設(shè)立了“中藥材產(chǎn)地加工與炮制一體化”行業(yè)專項(xiàng)。通過中藥材產(chǎn)地加工與炮制一體化研究，省去浸泡軟化工序，縮短了干燥時(shí)間，避免了有效成分的流失，節(jié)省了人力物力，降低了中藥飲片成本，提高了中藥飲片質(zhì)量，從而確保中藥飲片的臨床安全、有效。

延胡索來源于罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)，藥用部位是塊莖，主產(chǎn)于浙江、陜西、安徽等地。近年來，隨著栽培面積的增加，陜產(chǎn)延胡索已達(dá)全國(guó)延胡索總量的70%[1]。延胡索味辛、苦，性溫，具有活血利氣、止痛的作用[2]。臨床主要用于胸脅、脘腹疼痛、胸痹心痛、產(chǎn)后瘀阻等證的治療。藥理研究表明，延胡索生物堿對(duì)心血管[3-4]、神經(jīng)[5-6]、消化[7]、內(nèi)分泌等系統(tǒng)均具有明顯的作用[8-9]。

目前，關(guān)于延胡索指紋圖譜的研究主要集中在不同產(chǎn)地延胡索藥材、鮮品與炮制品的對(duì)比、生品和制品延胡索質(zhì)量差異分析[10-13],但延胡索產(chǎn)地加工與炮制一體化的指紋圖譜研究還未見報(bào)道。本課題組前期對(duì)延胡索產(chǎn)地加工工藝進(jìn)行了研究[14]，后期采用醋炙法、醋蒸法等炮制方法對(duì)其炮制，并對(duì)不同炮制方法對(duì)其質(zhì)量的影響進(jìn)行了比較分析，本文在此基礎(chǔ)上對(duì)延胡索產(chǎn)地加工與炮制一體化進(jìn)行系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)選取陜產(chǎn)延胡索，以其所含的兩種生物堿對(duì)照品作為指示，對(duì)其不同的產(chǎn)地加工與炮制一體化樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，為延胡索飲片的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(Waters公司)；BT-25S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500E型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品及試劑

延胡索采自陜西城固縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡本祥教授鑒定為罌粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW. T. Wang)的干燥塊莖；延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)110726-201616)、原阿片堿對(duì)照品(批號(hào)110853-201604)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 延胡索產(chǎn)地加工與炮制一體化工藝樣品的制備

新鮮延胡索:取新鮮延胡索100 g，除去雜質(zhì)，洗凈，切片，干燥。醋炙鮮藥：取新鮮延胡索100 g，加入醋拌勻(20 ml)，悶潤(rùn)至醋被吸收完全后，置炒制容器內(nèi)用文火加熱炒干，取出晾涼，切片。醋煮鮮藥：取新鮮延胡索100 g，加入醋(20 ml)與適量水(平藥面)，置煮制容器內(nèi)煮至透心。待醋液被吸盡時(shí)，取出，晾至六成干，切片，干燥。水煮延胡索：取新鮮延胡索100 g，煮至透心，晾至六成干，切片，干燥。醋煮水煮品：取水煮延胡索100 g，按照(醋煮鮮藥)同法處理。醋炙水煮品：取水煮延胡索100 g, 按照(醋炙鮮藥)同法處理。傳統(tǒng)加工炮制：取新鮮延胡索100 g，置沸水中煮至恰無(wú)白心時(shí)，取出，干燥，再加適量水軟化，切片，干燥。

2.2 色譜條件[15]

Hypurity C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值6.0)，線性梯度洗脫(見表1)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，洗脫時(shí)間75 min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

表1 流動(dòng)相線性洗脫梯度

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取延胡索乙素、原阿片堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成含延胡索乙素61.8 μg/ml、原阿片堿109.6 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取樣品0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶，加入濃氨試液-甲醇(1∶20)混合液50 ml，稱重，浸漬1 h后加熱回流1 h，放涼后再稱重，補(bǔ)足重量，搖勻，濾過。量取續(xù)濾液25 ml，于蒸法皿蒸干，用甲醇溶解定容到容量瓶(5 ml)中，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 空白溶劑的考察

取甲醇溶液，在已確定的色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果表明溶劑對(duì)色譜峰無(wú)干擾。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取延胡索樣品S3，按“2.4項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取延胡索樣品S3，按“2.4項(xiàng)”下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取延胡索樣品S3，按“2.4項(xiàng)”下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 指紋圖譜的建立

取延胡索樣品7批，按照“2.4項(xiàng)”下方法制備供試品溶液并測(cè)定，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)進(jìn)行分析，以延胡索樣品(S3)的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)矢量法進(jìn)行多點(diǎn)校正生成對(duì)照指紋圖譜，7批延胡索 HPLC指紋圖譜共有模式及對(duì)照指紋圖譜見圖1。

圖1 7批延胡索樣品指紋圖譜共有模式(A)及對(duì)照指紋圖譜(B)

圖2 混合對(duì)照品HPLC圖注：1.原阿片堿；2.延胡索乙素

2.6.2 共有峰的標(biāo)定

據(jù)7批延胡索樣品的檢測(cè)結(jié)果，采用相似度評(píng)價(jià)軟件的數(shù)據(jù)匹配功能，在對(duì)照指紋圖譜上標(biāo)定出17個(gè)共有色譜峰，見圖1(B)。取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。將混合對(duì)照品溶液與樣品色譜圖進(jìn)行比對(duì)，在已確定的17個(gè)共有峰中，指認(rèn)出2個(gè)成分，其中6號(hào)峰為原阿片堿，13號(hào)峰為延胡索乙素，其余為未知峰。在樣品圖譜中選擇峰面積較大，出峰時(shí)間適中的8號(hào)色譜峰作為參照峰(S)，以參照峰的峰面積和保留時(shí)間作為1，分別計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，見表2～3。結(jié)果其共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1%，相對(duì)峰面積的RSD在4%～29%，結(jié)果表明不同的產(chǎn)地加工與炮制一體化工藝得到的飲片成分相似，共有成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，推測(cè)可能由于受到不同的加工炮制方法的影響。

表2 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 共有峰的相對(duì)峰面積

2.6.3 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)軟件，將7批延胡索樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入，以中位數(shù)矢量法生成對(duì)照指紋圖譜。由于采用梯度洗脫的方式及實(shí)驗(yàn)中不可避免因素的影響，各供試品指紋圖譜色譜峰保留時(shí)間會(huì)產(chǎn)生一定遷移，因而不采用自動(dòng)校正的方式，而是通過多點(diǎn)校正法對(duì)色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行校正，以S3作為相似度計(jì)算時(shí)校正的參考，最終生成延胡索產(chǎn)地加工與炮制一體化樣品的對(duì)照指紋圖譜。計(jì)算各批次延胡索樣品的指紋圖譜相似度，結(jié)果表明有較高的相似性，見表4。由相似度結(jié)果可知，以上樣品與對(duì)照譜相比較，除S1樣品外，其余6批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9，與對(duì)照指紋圖譜有較好的相似性，表明這幾種處理方法差異較小，而S1樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度小于0.9，可能是因?yàn)镾1樣品是鮮品，與其它樣品的處理方法相比相差較大。

2.6.4 系統(tǒng)聚類分析

以標(biāo)定的共有峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接法，以歐式距離的平方為測(cè)度，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3峰面積聚類結(jié)果可以看出樣品可分為三類， 2，3，5，1樣品為第一類， 4，6樣品為第二類， 7樣品為第三類。結(jié)合相似度分析結(jié)果可知三類共有峰的峰面積相比是有差異的，可能與加工方法不同有關(guān)。聚類分析得到樣品之間的相關(guān)性與相似度的計(jì)算結(jié)果較為一致。

表4 7批延胡索樣品指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

圖3 系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

3 討論

3.1 提取和分析方法的考察

采用濃氨試液-甲醇(1∶20)和濃氨試液-乙醇(1∶20)提取溶劑加熱回流提取，結(jié)果采用濃氨試液-甲醇(1∶20)提取溶劑出峰數(shù)較多且分離度好，所以選擇濃氨試液-甲醇(1∶20)作為提取溶劑。

分析比較甲醇-水，乙腈-水兩種流動(dòng)相系統(tǒng)表明，延胡索樣品在乙腈-水體系下出峰較多且色譜峰分離較好，所以采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

在配置流動(dòng)相時(shí)，剛開始采用pH試紙調(diào)節(jié)pH值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色譜圖重復(fù)性不好，而且每換一次流動(dòng)相，色譜峰峰位、峰形就會(huì)有所變化，后來采用精密pH計(jì)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，由于pH值調(diào)節(jié)準(zhǔn)確，生物堿在pH值6.0可以完全處于解離狀態(tài)，能夠在色譜圖上很好的呈現(xiàn)出來，且色譜峰峰位、峰形穩(wěn)定。

設(shè)定不同的洗脫梯度，根據(jù)其洗脫梯度下的色譜峰的峰形及分離度，最終確定最佳洗脫梯度為“2.2項(xiàng)”下梯度。

3.2 指標(biāo)性成分的選擇

費(fèi)艷美等[10]以延胡索乙素、原阿片堿為指標(biāo)性成分，建立延胡索藥材指紋圖譜。實(shí)驗(yàn)研究表明，延胡索乙素、原阿片堿等均為延胡索中有效成分，有較好的藥理作用。延胡素乙素[16]通過調(diào)節(jié)大鼠腦缺血-再灌注過程中細(xì)胞膜Na+-K+-ATP 酶和Ca2 +-ATP 酶的活性、拮抗鈣離子兩方面減輕腦缺血-再灌注損傷，且對(duì)小鼠肝損傷也具有保護(hù)作用[17]，原阿片堿和延胡索乙素對(duì)結(jié)扎幽門等多種原因誘發(fā)的胃黏膜損傷具有明顯的保護(hù)作用[18]。這些有效成分在建立的指紋圖譜中都有較好的顯示，故將其作為指標(biāo)性成分。

3.3 指紋圖譜研究

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，通過查閱文獻(xiàn)和全波長(zhǎng)掃描的方法共同確定了指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)，以延胡索乙素、原阿片堿作為指標(biāo)性成分而建立指紋圖譜，確定了17個(gè)共有峰。延胡索樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，與對(duì)照指紋圖譜相比，除S1樣品外，其余樣品的相似度高(0.9～1.0)，表明經(jīng)過進(jìn)一步加工炮制后的樣品相似度較好，且各個(gè)共有峰保留時(shí)間穩(wěn)定，符合指紋圖譜技術(shù)要求。延胡索新鮮品(S1)直接凈制，切片，未經(jīng)過進(jìn)一步炮制加工，所以其指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜相比相似度較低。

本實(shí)驗(yàn)比較了延胡索不同產(chǎn)地加工與炮制一體化樣品的指紋圖譜，相似度高，其共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，但相對(duì)峰面積的RSD差異較大，表明各種加工炮制方法得到的藥材成分相似，但各共有成分的量比例差異較大，可能是受到不同的加工炮制方法的影響。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，建立了延胡索不同產(chǎn)地加工炮制品的指紋圖譜，標(biāo)定了17個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中的2個(gè)成分，相似度較好，聚類分析結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，該研究建立的延胡索HPLC指紋圖譜可為其鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要參考。

對(duì)比新鮮延胡索(S1)和進(jìn)一步加工炮制后的延胡索樣品的指紋圖譜可以看出，加工炮制對(duì)延胡索的HPLC圖譜有影響。相對(duì)于新鮮延胡索S1，進(jìn)一步炮制加工后的延胡索樣品的HPLC色譜峰明顯不同，炮制后的延胡索乙素和原阿片堿的色譜峰峰面積增加，但是前者增加的幅度更大一些。另外，其他色譜峰峰面積也有所變化，對(duì)于其成分的定性尚需進(jìn)一步研究。