佟輝，李濤，申川，彭承宏，邱偉華，沈柏用，祝哲誠

肝癌組織在體內(nèi)往往處于過度增生狀態(tài)。由于癌細胞無限增殖，導(dǎo)致肝癌組織血管過度增生。肝癌組織高強度的生理活動耗氧明顯，使細胞局部微環(huán)境處于缺氧狀態(tài)。然而，肝癌細胞并沒有因為缺氧而發(fā)生一系列的細胞凋亡，仍具有旺盛的增生活力。細胞自噬是在缺血缺氧狀態(tài)下發(fā)生的自我吞噬內(nèi)部成分物質(zhì)的分解代謝過程。通過自噬泡包裹細胞內(nèi)受損、衰老的蛋白質(zhì)和細胞器，運輸?shù)饺苊阁w，水解成氨基酸，被細胞重新利用[1，2]。適度的細胞自噬可使細胞避開不良生長環(huán)境，獲得生命必須物質(zhì)。自噬的分子調(diào)控機制復(fù)雜，目前尚未明確。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類 22個核甘酸左右的高度進化保守性的非編碼單鏈小RNA，能結(jié)合信使RNA的3'端非翻譯區(qū)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平后的基因翻譯。miRNA參與了胚胎發(fā)育、細胞增殖和分化、免疫、病毒感染等一系列生命活動。此外，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細胞凋亡也有著密切的聯(lián)系[3]。作為miRNA家族的一員，let-7a可調(diào)控多種腫瘤細胞多種癌基因信號通路，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲等方面也有重要的作用，對腫瘤組織有明顯的抑制作用。let-7a與cyc D1和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 關(guān)系密切，參與對細胞周期G1期的調(diào)控[4]。然而，在缺氧狀態(tài)下let-7a對原發(fā)性肝癌細胞自噬和細胞增殖的影響還未見有報道。本研究建立了缺氧型原發(fā)性肝癌HCCLM3細胞模型，探討了let-7a調(diào)控細胞自噬對細胞增殖的影響，為原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、儀器與試劑 HCCLM3細胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫）、DnJ-4249CO2培養(yǎng)箱（美國REVCO公司）、DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技中國有限公司）、胰酶（美國Gibco公司）、四甲基偶氮唑藍（北京廣源恒信科技發(fā)展有限）、胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司）、let-7a-mimics（上海伯豪生物技術(shù)有限公司）、吖啶橙（碧云天生物技術(shù)公司）、細胞周期測試試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）、檢測let-7a、cyc D1蛋白和VEGF蛋白的ELISA試劑盒（南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司）、DMI3000 B倒置顯微鏡（德國LEICA公司）、MK3酶標(biāo)儀（美國 Thermo公司）、恒溫培養(yǎng)箱grp-9080（美國通用公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技中國有限公司）、超凈工作臺（上海恒躍醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 HCCLM3細胞復(fù)蘇培養(yǎng)及其分組設(shè)計 將裝有HCCLM3細胞株的凍存管從液氮中取出，在37℃水浴箱中迅速解凍，無菌吸管吸取菌液加入5 ml EPP無菌管中，1500 r/m離心5 min，吸棄上清液，加入pH值為7.2、含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/ml、青霉素 100 μg/mL的 RPMI-1640培養(yǎng)基，直至 5 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d 換液。當(dāng)細胞融合率達到80%時，用0.5%胰蛋白酶消化、傳代。分組設(shè)計:常氧組：取HCCLM3細胞懸液（細胞數(shù)為5×106/ml）10 ml，于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于 CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、20%O2）；缺氧組：取 HCCLM3細胞液（細胞數(shù)為5×106/mL）10 mL于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于 CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、2%O2、93%N2）；缺氧let-7a組：取轉(zhuǎn)染let-7a-mimics的HCCLM3細胞液（細胞數(shù)為5×106/ml）10 ml于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、2%O2、93%N2）。以上各組每孔設(shè) 6個平行孔，培養(yǎng)72 h。

1.3 let-7a-mimics轉(zhuǎn)染HCCLM3細胞 取HCCLM3細胞懸液（細胞數(shù)為5×106/ml）11 ml，接種于6孔板。取100 pmol的miRNA于200 μl DMEM培養(yǎng)基中，取 lipofectamine2000 4 μl，于 200 μl DMEM 培養(yǎng)基中，混勻，室溫培育30 min，無菌PBS洗滌細胞，將混合液加入細胞孔內(nèi)，6 h后棄混合液，加入含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 HCCLM3細胞自噬測定 于各組HCCLM3細胞培養(yǎng)結(jié)束前0.5 h，在細胞培養(yǎng)液中加入吖啶橙染液（1μg/ml），常溫染色30 min，無菌PBS洗滌清洗,于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色變化。細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)酸性自噬小體（紅色），說明細胞發(fā)生自噬，為陽性細胞；細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，說明細胞未發(fā)生自噬，為陰性細胞。于高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞，并計算陽性細胞比率。

1.5 HCCLM3細胞增殖活力檢測 采用MTT法，在染毒結(jié)束后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml）10 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，每孔加入OMSO 150 μl，在酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度（A）值，計算細胞存活率[細胞存活率=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）]。

1.6 HCCLM3細胞周期和自噬率測定 各組細胞于轉(zhuǎn)染后72 h用胰酶消化,用無菌PBS液清洗,加入70%乙醇重懸細胞，4℃冰箱過夜。次日，加入RNA酶溶液，室溫30 min，加入碘化丙啶0.8 mL，30 min后上流式細胞儀檢測分析。

1.7 HCCLM3 細胞培養(yǎng)上清液 let-7a、cyc D1、VEGF水平測定 在染毒結(jié)束后，5000 r/m離心，收集各組細胞，加入PBS制成細胞懸液，3000 r/m離心,收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Epidata和SPSS 19.0軟件錄入數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HCCLM3細胞增殖情況比較 缺氧組細胞存活率顯著高于常氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.40，P<0.05）；缺氧let-7a組細胞存活率顯著高于常氧組或缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.34，t=11.34，P<0.05，表1）。

2.2 各組HCCLM3細胞周期G1期和細胞自噬情況比較 缺氧組細胞周期G1期低于常氧組，自噬率高于常氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.78、t=18.60，P<0.05）；缺氧let-7a組細胞周期G1期高于常氧組或缺氧組，自噬率低于常氧組或缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.34、t=16.25、t=13.78、t=18.34，P<0.05，表2）。

表2 各組HCCLM3細胞周期G1期和細胞自噬率（%）比較

2.3 各組HCCLM3細胞上清let-7a、cyc D1和VEGF水平比較 缺氧組let-7a蛋白水平低于常氧組，而cyc D1和VEGF水平高于常氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.65、t=17.34、t=18.26，P<0.05）；缺氧 let-7a組let-7a高于常氧組或缺氧組，而cyc D1和VEGF低于常氧組或缺氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.78、t=17.90、t=21.33、t=19.43、t=17.34、t=22.54，P<0.05，表3）。

表3 各組HCCLM3細胞上清蛋白水平(μmol/L，±s)比較

表3 各組HCCLM3細胞上清蛋白水平(μmol/L，±s)比較

與常氧組比，①P<0.05；與缺氧組比，②P<0.05

孔數(shù) let-7a蛋白常氧 6 65.3±5.2缺氧 6 33.4±7.1①缺氧 let-7a 6 96.1±9.3①②cyc D1蛋白98.2±6.7 124.1±7.2①72.3±8.8①②VEGF 85.2±8.1 114.1±5.2①56.3±6.3①②

3 討論

作為高度進化保守性的非編碼小 RNA，let-7a mi RNA在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用，在調(diào)控細胞的基因表達方面也扮演重要角色。經(jīng)典的mi RNA調(diào)控路徑是與靶m RNA的3’端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯[5-7]。此外，let-7a還可與靶mRNA的5’端結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用。let-7a作用于Dicer酶mRNA的5’端，直接抑制Dicer酶[8-10]；對3’端非編碼區(qū)的多聚腺苷酸的脫腺苷化在let-7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶mRNA過程中也具有一定的作用，但這種作用還不是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要機制[12-15]。

細胞自噬是高等脊椎動物細胞內(nèi)一種利用溶酶體對細胞器進行降解的生物學(xué)過程。細胞自噬與生物體生長發(fā)育、細胞分化和對環(huán)境的應(yīng)答密切相關(guān)，也與生物體各種病理、生理活動關(guān)系密切[16-18]。

本研究結(jié)果表明，HCCLM3細胞在缺氧環(huán)境下，細胞內(nèi)let-7a表達明顯下降，細胞自噬率明顯低于常氧下的表現(xiàn)，細胞增殖也明顯增高。在缺環(huán)環(huán)境下，通過轉(zhuǎn)染let-7a-mimics，細胞內(nèi)let-7a表達明顯升高，甚至高于缺氧環(huán)境下let-7a的表達，而細胞自噬率也明顯升高，達到最高水平，進而細胞增殖受到抑制，結(jié)果說明通過上調(diào)let-7a在肝癌HCCLM3細胞的表達，能誘發(fā)細胞自噬，抑制細胞在缺氧環(huán)境中的增殖。

本研究結(jié)果顯示，上調(diào)let-7a在肝癌HCCLM3細胞的表達，肝癌HCCLM3細胞處于G1期的比例明顯增多，使得細胞在G1期往S期的分化發(fā)生障礙。CYC D1和VEGF均是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖的重要調(diào)節(jié)因子，上調(diào)let-7a在肝癌HCCLM3細胞的表達，結(jié)果使得CYC D1和VEGF表達明顯下降[19，20]。

綜上所述，上調(diào)let-7a在肝癌HCCLM3細胞的表達，能誘發(fā)細胞自噬，使得細胞停滯在在G1期增多，抑制細胞在缺氧環(huán)境中的增殖活動，其機制可能與CYC D1和VEGF表達下調(diào)有關(guān)。