李金艷，胡榮靜，曾 敏

(重慶市中醫(yī)院：1.婦產科；2.病理科 400021)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)增加新生兒的病死率，并且新生兒在成年后糖耐量異常及心血管疾病的發(fā)病率也隨之增高。FGR的發(fā)病機制目前尚不清楚。母胎間葡萄糖轉運出現異常可能與FGR的發(fā)生有著密切關系。葡萄糖是生長發(fā)育的胎兒和胎盤中有氧代謝的必需物質[1]。葡萄糖從母體血液中通過葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter,GLUT)介導轉運到胎兒體內。GLUT是一個蛋白家族，目前發(fā)現共有14個異構體，主要負責葡萄糖通過細胞膜的雙脂質層進入細胞內。人類胎盤滋養(yǎng)層上皮細胞中GLUT的主要成員包括GLUT1、GLUT3和GLUT4[2]。GLUT1主要分布在哺乳動物胎盤的合體滋養(yǎng)層，在整個妊娠期間呈高表達[3-4]。GLUT3通常在代謝率高的組織如受精卵植入前胚胎中的神經元和滋養(yǎng)外胚層中有表達[5]。GLUT3對葡萄糖有著較高的親和力，比GLUT1和GLUT4具有更高的葡萄糖轉運能力[6]。GLUT4是對胰島素敏感的異構體，GLUT4主要負責妊娠早期在胰島素存在條件下能夠促進葡萄糖母胎間轉運。研究表明FGR與先兆子癇有著相同的胎盤病因學，即胎盤滋養(yǎng)細胞不充分生長，導致子宮胎盤血流灌注減少使胎盤長期處于慢性缺氧狀態(tài)從而引起FGR的發(fā)生。本文研究FGR胎盤中GLUT3的表達情況，以明確其作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1-11月在本院住院分娩的FGR孕婦15例作為研究對象，年齡(27.3±2.4)歲,孕周(38.8±1.6)周，無其他產科的合并癥及并發(fā)癥。FGR的診斷標準參照謝幸主編《婦產科學》第8版。同期住院分娩的正常孕婦15例作為對照，無任何妊娠期合并癥和并發(fā)癥，年齡(26.8±1.6)歲，孕周(39.6±1.8)周。

1.2藥品和試劑 兔抗人GLUT3多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯示劑購自武漢博士德生物公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、PVDF膜、ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；GLUT3引物由上海生工設計引物序列并合成引物。

1.3方法

1.3.1測定新生兒、胎盤質量及標本采集 經陰道或剖宮產分娩的新生兒，娩出后擦干全身的羊水及血液稱取體質量并記錄。胎盤娩出后稱取質量并記錄。在胎盤中央靠近臍帶處取大小為2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm三角形的胎盤組織，測定胎盤組織厚度，將剪下胎盤分為兩個水平片段，底蛻膜為胎盤母體面，頂部絨毛膜表面為胎兒面，分別用于以下研究。

1.3.2免疫組化檢測GLUT3的表達 胎盤母體面和胎兒面常溫固定于4%多聚甲醛中24 h后，常規(guī)石蠟包埋并連續(xù)切片。具體操作步驟如下：胎盤切片用二甲苯脫蠟至水，用檸檬酸緩沖液高溫進行抗原修復，3%雙氧水滅活內源性酶，山羊血清封閉后加入一抗GLUT3，工作液濃度為1∶50,4 ℃過夜。加入SABC免疫組化試劑盒中生物素標記的羊抗兔IgG，加入HRP標記鏈親和素，DAB顯色后，蘇木素復染，中性樹脂封片。結果判定：以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，陰性反應為除細胞核染成藍色外，胞核和胞漿內無棕黃色反應物。采用Image-Pro Plus 6.0軟件系統對GLUT3在胎盤組織的表達進行定量分析，每張切片隨機選取10個完整不重疊的高倍鏡視野(×400)下陽性反應面積和陽性積分光密度，計算出平均光密度值(AOD),以每例10個視野AOD的平均值作為該例的測量值。

1.3.3RT-qPCR 按照RNA提取試劑盒說明書分別提取胎盤母體面和胎兒面總RNA，cDNA的合成按照逆轉錄試劑盒說明操作。人GLUT3基因引物由上海生物工程合成，上游引物5′-CAG GCA CAC GGT GCA GAT AG-3′,下游引物5′-GCA GGC TCG ATG CTG TTC AT-3′。反應體系20 μL。退火溫度為65 ℃，38次循環(huán)。用GAPDH作為內參照。每個樣品復孔3次，最后分析溶解曲線，用GLUT3與內參基因GAPDH基因表達量的比值來表示相對表達量。

1.3.4Western blot 胎盤組織稱重后剪細，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用勻漿機勻漿后，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。采用細胞裂解液配平各組之間蛋白濃度。加熱使蛋白變性。蛋白樣品上樣量為12 μL，行SDS-PAGE膠電泳分離，然后通過電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜30 min后，放入GLUT3抗體(1∶1 000)4 ℃過夜。PVDF轉至二抗羊抗兔IgG抗體(1∶6 000)室溫孵育2 h。β-actin作為內參。ECL發(fā)光液發(fā)光顯影檢測目的蛋白條帶的變化情況。采用Bio-Rad凝膠成像系統軟件分析目的條帶和內參條帶的灰度值。

2 結 果

2.1兩組新生兒出生體質量、胎盤質量、胎盤厚度 FGR組新生兒出生體質量、胎盤質量、胎盤厚度明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組新生兒出生體質量、胎盤質量、胎盤厚度比較

2.2GLUT3在胎盤組織表達情況 GLUT3在胎盤細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞上均有表達，主要表達于細胞膜和細胞質內。與對照組比較，FGR組胎盤組織母體面GLUT3表達呈強陽性。FGR組胎盤組織母體面GLUT3的AOD值(0.451±0.121)明顯高于對照組(0.277±0.093)，差異有統計學意義(P<0.05)。GLUT3在FGR胎盤組織胎兒面AOD值(0.252±0.102)與對照組(0.246±0.086)比較，差異無統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖2 RT-qPCR檢測兩組胎盤組織GLUT3 mRNA表達變化

A:Western blot蛋白條帶；B：兩組GLUT3灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖

2.3兩組胎盤組織GLUT3 mRNA的表達 FGR組胎盤組織母體面GLUT3 mRNA的表達水平(2.12±0.23)明顯高于對照組(0.46±0.13)，差異有統計學意義(P<0.05)。FGR組胎盤組織胎兒面GLUT3 mRNA的表達水平(0.55±0.18)與對照組(0.51±0.14)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.4兩組胎盤組織GLUT3蛋白的表達 與對照組比較，FGR組胎盤組織母體面GLUT3蛋白的表達(1.12±0.23)明顯高于對照組(0.48±0.13)，差異有統計學意義(P<0.05)。FGR組胎盤組織胎兒面GLUT3蛋白(0.55±0.09)與對照組(0.51±0.15)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

3 討 論

FGR在我國發(fā)病率為3%～7%，是一種嚴重的妊娠并發(fā)癥，圍產兒的病死率是正常胎兒的4～6倍，其新生兒遠期和近期并發(fā)癥均明顯升高[7]。葡萄糖是胎兒和胎盤主要的能量來源，是維持胎兒正常的代謝和生長的必需物質。葡萄糖轉運受到復雜的機制調控。葡萄糖通過胎盤組織從母體轉運到胎兒體內，而胎盤本身也會消耗葡萄糖[8]，當胎盤處于缺氧狀態(tài)時會過度消耗葡萄糖。胎兒組織攝取葡萄糖受葡萄糖轉運體的調控。GLUT3的分布有組織特異性，主要表達在代謝活躍的組織中如胎盤、大腦、視網膜的神經元。GLUT3對葡萄糖具有較低的Km,當底物的活性降低時GLUT3仍然可以保持活性。隨著妊娠增加，GLUT3在胎盤葡萄糖轉運中起著更重要的作用，影響胎盤滋養(yǎng)細胞的植入、分化[9]，參與妊娠早期和妊娠晚期胚胎發(fā)育的調控[10-11]，在妊娠晚期GLUT3逐漸代替GLUT1，隨著妊娠進展GLUT3在胎盤轉運葡萄糖方面起著更重要的作用。FGR時葡萄糖轉運體隨胎兒血糖濃度急性或慢性改變而出現相應的增加或降低。當胎盤中GLUT表達異常時，葡萄糖的轉運或利用受損，使胎兒葡萄糖攝取不足，通過研究發(fā)現FGR胎盤的GLUT3表達出現明顯改變。

本研究顯示，GLUT3主要表達于細胞滋養(yǎng)層細胞，部分表達于合體滋養(yǎng)層細胞。這與許多學者發(fā)現妊娠早期GLUT3在合體滋養(yǎng)層細胞中表達相一致[12]。GLUT3在FGR胎盤組織母體面表達呈強陽性，FGR胎盤組織母體面GLUT3 mRNA和蛋白明顯高于對照組，兩組間胎盤組織胎兒面差異無統計學意義(P>0.05)。以上研究結果表明，FGR胎盤的母體面和胎兒面對葡萄糖的轉運能力不同。既往研究表明從足月胎盤分離培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞處于缺氧狀態(tài)時GLUT3 mRNA表達增加[11]。來源于絨毛膜癌的滋養(yǎng)葉細胞隨著供氧壓力降低，GLUT3表達呈劑量依賴性增高，同時伴隨著上皮細胞的葡萄糖轉運增加[13]。因為FGR的胎盤絨毛血管發(fā)育異常，胎盤血流處于低灌注狀態(tài)，使胎盤絨毛間氣體交換下降，胎盤處于缺氧狀態(tài)，故推測因為FGR胎盤處在缺氧狀態(tài)導致胎盤組織母體面GLUT3表達增加，從而提高了葡萄糖從母體到胎盤的轉運，增加胎盤組織內葡萄糖以提供更多能量來適應胎盤缺氧狀態(tài)，但胎盤因缺氧過度消耗葡萄糖，導致轉運到胎兒體內的葡萄糖減少，從而FGR。另一方面，FGR胎盤組織母體面GLUT3表達增加可能與糖皮質激素增高有關系[14]。FGR發(fā)生時胎兒處于高水平的糖皮質激素環(huán)境中，胎盤組織母體面GLUT3表達增高是提高胎盤對葡萄糖的供應，以減輕胎兒暴露于糖皮質激素引起的胎兒低血糖[15]，但是胎盤過度消耗葡萄糖損害了葡萄糖向胎兒轉運，從而導致生長受限。

FGR嚴重程度與胎盤缺氧受損程度密切相關。FGR胎盤組織母體面GLUT3表達增高提示胎盤發(fā)生缺氧程度。胎盤因缺氧而過度消耗了葡萄糖，最終可能導致轉運到胎兒的葡萄糖降低，影響胎兒的生長發(fā)育。