王 燕，田 薇，劉 穎，靳 欽，張 曙

(南通大學附屬醫(yī)院病理科，江蘇南通 226001)

肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年約有60萬新增病例，死亡人數(shù)大于25萬[1]。目前臨床最常見的治療方法仍是手術切除和肝臟移植，另外腫瘤細胞對其化療藥索拉非尼極易產生耐藥性，且該藥毒性較強[2-3]。 因此，鑒定新型的生物分子標記對有效治療肝細胞癌是必要的。死亡結構域相關蛋白(Daxx)最初是YANG等發(fā)現(xiàn)的一種新型的高度保守蛋白，存在與人體正常細胞和腫瘤細胞中，Daxx在肝細胞癌中的表達及臨床意義國內鮮有報道。本研究應用組織芯片、免疫組化法及Western blot檢測其在肝細胞癌中的表達情況，分析其與臨床病理參數(shù)及預后的關系，探討其表達在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2017年 6 月5例肝細胞癌患者手術切除的新鮮癌組織及正常肝組織，凍存?zhèn)溆?。收?010-2012年280例患者的相關肝組織，其中130例肝細胞癌組織，18例肝炎組織，32例肝硬化組織及100例正常肝組織，術前患者均未經任何抗腫瘤治療，均有相應的臨床病理資料及隨訪記錄，隨訪率達100%，隨訪截至2017年6月。本研究符合人體試驗倫理學標準，并得到倫理委員會的批準，均經患者知情同意。

1.2試劑 鼠抗人Daxx抗體購于英國Abcam公司，HRP標記山羊抗鼠IgG購于美國Sigma公司，細胞核漿蛋白提取試劑盒購于中國碧云天生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購于中國北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1組織芯片聯(lián)合免疫組織化學法 收集的患者標本均經福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成組織芯片。經4 μm切片，脫蠟、水化、微波處理及抗原修復后，免疫組織化學行Daxx標記。陽性對照為自身對照，一抗的同型對照作為陰性對照。組織芯片結果由兩位高年資的病理診斷醫(yī)師在雙盲情況下進行結果判讀。陽性結果為細胞質或細胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。結果判讀：在高倍鏡下(×400)分別對每個位點計數(shù)100個細胞，計4個位點，共400個細胞，記錄染色強度和陽性細胞所占的百分比。染色強度：無著色0分，黃色弱陽性1分，淺棕色中陽性2分，棕褐色強陽性3分；陽性細胞百分比：≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；染色強度和陽性細胞百分比評分相乘，大于或等于1 分為陽性。

1.3.2Western blot 取5例新鮮肝細胞癌組織及正常肝組織，使用細胞核漿蛋白試劑盒分別提取提取核漿蛋白，經紫外分光光度儀蛋白定量后分別取50 μg進行Western blot檢測，內參為β-actin。最后加ECL顯色液顯影。

2 結 果

2.1Daxx在肝細胞癌中的表達 在正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織中Daxx蛋白主要表達于細胞核，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。在肝細胞癌中Daxx蛋白表達于細胞質，表達陽性率為30.8%(40/130)，見圖1；Western blot 結果與免疫組化結果一致，見圖2。

表1 Daxx蛋白在正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織中的表達情況[n(%)]

圖1 免疫組化檢測Daxx在不同分化程度的肝細胞癌及正常肝組織中的表達(×400)

A:肝細胞癌組織；B:正常肝組織；a:核蛋白；b:漿蛋白

2.2Daxx表達與肝細胞癌臨床病理參數(shù)的關系 Daxx在肝細胞癌中的表達與患者AFP、肝炎史、肝硬化史、腫瘤分化程度、TNM分期、門靜脈癌栓及Ki67表達相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、飲酒史、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小及腫瘤部位不相關(P>0.05)，見表2。

2.3預后分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示 Daxx陰性組患者的5年總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)比陽性組更短，見圖3。單因素生存分析顯示 Daxx的表達程度、TNM分期、門靜脈癌栓及Ki67表達程度與患者術后生存期相關(P<0.05)。COX比例風險回歸模型多因素分析進一步顯示Daxx表達程度、TNM分期及Ki67表達程度為影響OS及PFS的獨立危險因素，見表3、4。

表2 Daxx表達與肝細胞癌患者臨床病理參數(shù)的關系[n(%)]

續(xù)表2 Daxx表達與肝細胞癌患者臨床病理參數(shù)的關系[n(%)]

表3 單因素和多因素分析肝細胞癌患者臨床病理特征與OS的關系

續(xù)表3 單因素和多因素分析肝細胞癌患者臨床病理特征與OS的關系

表4 單因素和多因素分析肝細胞癌患者臨床病理特征與PFS的關系

圖3 肝細胞癌患者中Daxx不同表達的OS及PFS的生存曲線

3 討 論

肝細胞癌是一種起源于肝細胞的惡性腫瘤，是全球第二大癌癥殺手，第三大癌癥死因，在我國發(fā)病率居世界首位。到目前為止，肝細胞癌的發(fā)病率和病死率居高不下，因此有必要尋找更為有效更為安全的生物治療方案。

Daxx基因定位于6號染色體短臂2區(qū)1帶3亞帶，全長約315 kb，含有7個外顯子、6個內含子及4個結構域(酸性氨基酸結構域1個、配對兼性雙螺旋2個、 SPT結構域1個)，它們共同參與了Daxx的轉錄調控。Daxx蛋白含有740個氨基酸，由于轉錄后修飾的不同，存在3種不同的形式，相對分子質量為120×103、97×103和70×103。

Daxx是一種多功能蛋白，可與多個蛋白相互作用，共同參與細胞凋亡。其生物活性的發(fā)揮與其在亞細胞間的分布、表達、定位及轉位相關。有研究最初提出Daxx在胞漿中是作為Fas蛋白的下游，參與其凋亡通路發(fā)揮促凋亡作用，但最新研究發(fā)現(xiàn)，Daxx在T細胞存活中發(fā)揮了新的作用，但在Fas誘導的細胞凋亡中是不必要的[4]；另外，Daxx可作為細胞凋亡的啟動子與細胞凋亡信號調節(jié)激酶1(ASK1)相互作用，通過JNK和p38途徑啟動凋亡；也可以和前列腺細胞凋亡反應蛋白4(PAR-4)通過ZIP激酶的磷酸化來誘導凋亡[5]。而當Daxx定位于細胞核時，它可以抑制諸如ETS143、Pax342、NF-κB、E2F120、p53和p73等轉錄因子的表達[6]，進而發(fā)揮抗細胞凋亡作用，另有研究發(fā)現(xiàn)Daxx可發(fā)揮潛在的抗細胞凋亡的功能[7]。

Daxx與多種腫瘤如胰腺神經內分泌腫瘤、卵巢癌及膠質母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]。NETSAWANG等[9]在研究登革病毒衣殼蛋白(DENVC)的過程發(fā)現(xiàn)，Daxx 能夠與核內定位的 DENVC共同誘導肝細胞癌HepG2 細胞的凋亡，其高表達能夠促進HepG2細胞凋亡，該凋亡與過氧化氫相關。Daxx能特異的結合于原癌基因c-met啟動子區(qū)域，同時有HDAC2水平的升高，可見HDAC2參與Daxx對c-met啟動子的轉錄抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌及非小細胞肺癌中，Daxx與c-met表達成負相關，進一步說明Daxx對c-met的轉錄有一定的抑制作用[10]，而c-met基因過表達是肝細胞癌手術切除患者復發(fā)和生存的不良預后因素[11]，由此可以推斷Daxx可能與肝細胞癌的預后相關。

另一方面，Daxx在病毒的防御及抑制轉錄等方面也發(fā)揮了巨大的作用。近年研究顯示，Daxx可與多種細胞因子及病毒蛋白相互作用，共同參與調節(jié)病毒的復制周期，而一些病毒蛋白的合成或病毒的感染又可反過來影響 Daxx 在細胞內的定位，進而影響其功能的發(fā)揮[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，ZIP激酶可與Daxx共定位，與PML一起維持PML-NBs結構與功能的穩(wěn)定性，該穩(wěn)定不利于病毒的復制及轉錄[13]。另外Daxx也參與了HSV-1 ICP27對NF-κB活性的抑制[14]。

本研究顯示，Daxx蛋白主要表達于正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織的細胞核，肝細胞癌組織的細胞質，并且與患者的AFP、肝炎史、肝硬化史、腫瘤分化程度、TNM分期、門靜脈癌栓及Ki67表達有關，由此推測Daxx蛋白可能與肝炎病毒相互作用，而病毒的感染影響了該蛋白在細胞中的定位，導致其由細胞核轉位到細胞質，進而發(fā)揮抑制肝細胞癌細胞凋亡的作用。進一步分析Daxx在肝細胞癌組織中的表達與患者預后的相關性，結果表明Daxx是影響肝細胞癌預后的因素之一。

綜上所述，Daxx的高表達有可能抑制肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉移，可作為判斷肝細胞癌預后的獨立因子，具體的作用機制及其與肝炎病毒的關系有待于進一步的研究和探索。