陳業(yè)文,張 灝，甘亞平，張 偉，吳 吉，諶啟敏，張 靜，王 娛，劉復(fù)興，寧志豐,△

(1.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭 515041)

巖白菜素是從矮虎耳草植物中提取的一種活性成分，具有抗炎、收斂、解痙的作用，近年來，有少數(shù)報(bào)道指出巖白菜素有抗腫瘤的作用。在本文中，作者報(bào)道了巖白菜素對(duì)肝癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 肝癌HepG2細(xì)胞購自美國培養(yǎng)物典藏中心(ATCC)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，DEN、DMSO、巖白菜素購自美國Sigma公司，雙抗購自Hyclone公司，Wistar大鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其他試劑為生化分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI1640培養(yǎng)基添加10% FBS和100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素在5% CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)予以傳代。

1.2.2大鼠肝癌模型的建立 在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)4周齡雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性培養(yǎng)1周后將30只大鼠分成兩組，每組各15只，對(duì)照組予以常規(guī)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上飲用水中添加0.01%DEN，18周末將大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡后取肝臟，計(jì)算結(jié)節(jié)大小和數(shù)目，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異。

1.2.3四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法 常規(guī)培養(yǎng)HepG2，待細(xì)胞密度達(dá)85%左右時(shí)終止培養(yǎng)，消化、離心、重懸浮為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以每孔10 000個(gè)細(xì)胞種入96孔板，巖白菜素設(shè)置濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)72 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，震蕩10 min，結(jié)晶溶解充分，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度(A)值。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)HepG2，待細(xì)胞密度達(dá)85%左右時(shí)終止培養(yǎng)，消化、離心、重懸浮為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以每孔300個(gè)細(xì)胞種入6孔板，巖白菜素設(shè)置濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，常規(guī)培養(yǎng)2周，待大多數(shù)克隆大于50 μmol/L時(shí)終止培養(yǎng)，吸去舊的培養(yǎng)基后，PBS洗3次，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min后流水輕輕洗去結(jié)晶紫，在100倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=陽性克隆數(shù)/種板細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)HepG2，待細(xì)胞密度達(dá)85%左右時(shí)終止培養(yǎng)，消化、離心、用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸浮為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以每孔100 000個(gè)細(xì)胞種入12孔板的Transwell小室上室，下室加入500 μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基，上下室內(nèi)均加入巖白菜素，設(shè)濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，常規(guī)培養(yǎng)約36 h，終止培養(yǎng)，取出小室，用棉簽輕輕蘸去上室內(nèi)底部未穿出細(xì)胞后，對(duì)小室予以染色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算每高倍視野下小室底部穿出細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：除小室底部鋪有50 μL Matrigel(5 mg/L)外，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1巖白菜素抑制肝癌HepG2細(xì)胞的存活能力 本研究選用0.6 mmol/L的一定濃度梯度的巖白菜素來檢測對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞存活能力的影響，發(fā)現(xiàn)巖白菜素能顯著抑制HepG2細(xì)胞的存活能力(P=0.029 9)，見圖1。

*：P<0.05

圖1巖白菜素抑制肝癌HepG2細(xì)胞的存活能力

2.2巖白菜素抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的平板克隆形成能力 一定濃度梯度的巖白菜素(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的平板克隆形成能力(P<0.01)，見圖2。

圖2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

2.3巖白菜素抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力 一定濃度梯度的巖白菜素(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的遷移(P=0.009 8)和侵襲能力(P=0.006 9)，見圖3。

A:遷移細(xì)胞數(shù)；B:侵襲細(xì)胞數(shù)

圖3 Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

2.4巖白菜素抑制了大鼠肝癌模型的生長 成功構(gòu)建大鼠肝癌模型，發(fā)現(xiàn)10 mg/kg的巖白菜素灌胃2周可以顯著減慢肝癌的生長見圖4，延長存活時(shí)間見圖5。

a：P<0.01

圖4兩組大鼠肝癌模型腫瘤總體積

a：P<0.05

圖5兩組大鼠肝癌模型存活時(shí)間

3 討 論

越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激及由此產(chǎn)生的活性氧類物(ROS)與各種常見疾病如動(dòng)脈粥樣硬化[1]、癌癥發(fā)生[2-3]、衰老[4-5]、糖尿病[6]等有關(guān)，人體在細(xì)胞有氧代謝、持續(xù)的應(yīng)激、暴露于紫外線或X射線可產(chǎn)生各種ROS[7-8]，這些ROS在細(xì)胞信號(hào)和對(duì)細(xì)胞因子、生長因子、激素作用、轉(zhuǎn)錄、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)和凋亡的調(diào)節(jié)中起重要的作用[9]。因此，人們將目光轉(zhuǎn)向食物中具有治療此類疾病的抗氧化物。巖白菜素即是從植物矮虎耳草中提取的天然抗氧化物。2002年，SUMINO等[10]報(bào)道從紫金牛屬植物中分離出巖白菜素和去甲氧巖白菜素以及其他13種化合物，發(fā)現(xiàn)這些化合物具有清除二苯基苦味?；诫伦杂苫?，對(duì)鼠乳腺癌細(xì)胞系FM3A有細(xì)胞毒性作用。2003年，MISHIMA等[11]發(fā)現(xiàn)印度龍腦香的乙醇提取物對(duì)小鼠肉瘤180細(xì)胞有顯著抑制作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)僅29.5 μmol/L，這些乙醇提取物中含有較高比例的巖白菜素。2010年，NEWELL等[12]報(bào)道了從6種紫金牛屬植物中提煉出的化合物中巖白菜素、蒽貝素、槲皮素均對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，其中以巖白菜素的抑瘤作用最強(qiáng)，初步研究發(fā)現(xiàn)其可能機(jī)制為引起細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，但是對(duì)于巖白菜素的抑肝癌作用沒有系統(tǒng)研究。2012年，RIGHESCHI等[13]發(fā)現(xiàn)他們實(shí)驗(yàn)室合成的巖白菜素對(duì)T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞CCRF-CEM及其耐藥株有較強(qiáng)的抑制作用。2013年，ZHANG等[14]證實(shí)從雙翼豆科木的水提物中分離出來的巖白菜素和沒食子酸對(duì)淋巴瘤Rajj細(xì)胞和α-黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)刺激產(chǎn)生的B16黑色素瘤細(xì)胞均有抑制作用，其中對(duì)淋巴瘤的抑制作用是通過激活EB病毒早期抗原(EBV-EA)提高機(jī)體免疫力來實(shí)現(xiàn)的。

巖白菜素不溶于水，但是可溶于DMSO。本研究發(fā)現(xiàn)，使用DMSO做溶劑，低于1.0 mmol/L的巖白菜素即可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在抗增殖實(shí)驗(yàn)中，巖白菜素能夠抑制肝癌HepG2的存活能力，并呈時(shí)間和劑量依賴性，克隆形成能力是腫瘤細(xì)胞所具有的一種特性，反映單個(gè)細(xì)胞的集落形成能力。在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)的巖白菜素能夠抑制肝癌HepG2的集落形成能力。肝癌是高度惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，在Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)較低濃度的巖白菜素能夠明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究利用DEN構(gòu)建了Wistar大鼠肝癌模型，發(fā)現(xiàn)10 mg/kg的劑量能夠顯著改善大鼠肝癌模型的存活狀態(tài)，如毛發(fā)的光亮程度、活動(dòng)度，減慢了大鼠肝癌的生長，延長了大鼠的存活時(shí)間。

總之，本研究已初步發(fā)現(xiàn)巖白菜素能夠抑制肝癌，包括細(xì)胞株和動(dòng)物模型，在臨床上，巖白菜素被用來治療支氣管炎和哮喘，該發(fā)現(xiàn)將有望拓展巖白菜素的治療范圍。