廖 蘭，張風(fēng)麗，李章發(fā)，陳林萍，林維杰，楊彥紅，文曉艷，倪 莉

小麥?zhǔn)俏覈?guó)三大糧食來(lái)源之一[1]。小麥蛋白是小麥的副產(chǎn)物，主要由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成，被當(dāng)作食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[2-4]。麥醇溶蛋白對(duì)面團(tuán)的延展性有重要影響，可分為4 種類型，即α-、β-、γ-和ω-醇溶蛋白[5-8]，其中α-醇溶蛋白毒性最大，是引起乳糜瀉的主要蛋白質(zhì)[9-12]。由于小麥醇溶蛋白不同亞基類型和麥谷蛋白具有較高的分子同源性，因此用傳統(tǒng)分離純化方法分離出α-醇溶蛋白難度較大[13]。目前，利用大腸桿菌表達(dá)、提取蛋白，測(cè)定揉混實(shí)驗(yàn)參數(shù)已經(jīng)成為研究α-醇溶蛋白功能的重要方法。李敏[14]利用Escherichia coli體外表達(dá)表達(dá)得到α-醇溶蛋白，將其添加到基礎(chǔ)面粉中，利用粉質(zhì)儀研究其對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性影響，發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白會(huì)使面團(tuán)帶寬和機(jī)械耐力系數(shù)有所增加，而縮短面團(tuán)的穩(wěn)定時(shí)間和形成時(shí)間。劉國(guó)娟[15]發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白可以縮短揉面時(shí)間并增加面團(tuán)耐揉性。小麥面筋蛋白含有大量的疏水性氨基酸谷氨酰胺和天冬酰胺，導(dǎo)致其難溶于水，限制了其在食品行業(yè)上的應(yīng)用[16]。脫酰胺改性可以將酰胺基轉(zhuǎn)化為羧基從而提高其溶解性[17]。Shih[18]、Liao Lan[19]和Wang Yongquan[20]等的研究發(fā)現(xiàn)酸可以更加有效地將酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)轸然瑥亩纳菩←溍娼畹鞍椎墓δ苄再|(zhì)。Berti等[21]發(fā)現(xiàn)醋酸可以降低小麥蛋白的致敏性。本研究通過(guò)體外克隆表達(dá)的方法得到α-醇溶蛋白，利用檸檬酸對(duì)α-醇溶蛋白進(jìn)行脫酰胺改性，并將其添加到面粉中，研究脫酰胺改性α-醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)變化對(duì)面條質(zhì)地的影響，為進(jìn)一步研究檸檬酸改性對(duì)α-醇溶蛋白致敏性的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pUC57-α-gliadin由實(shí)驗(yàn)室保存；克隆和表達(dá)試劑、DNA凝膠回收純化試劑盒 大連寶生物工程有限公司；周麥28面粉 河南周園種業(yè)有限公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VeritiTM96-well聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）梯度擴(kuò)增儀 Applied Biosystems（中國(guó)）科技有限公司；JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；8210E傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)尼高力儀器公司；FluoroMax-4熒光分光光度計(jì) 法國(guó)Horiba Jobin Yvon公司；SH-4000掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 韓國(guó)HIROX公司。

1.3 方法

1.3.1 pUC57-α-gliadin轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及序列分析

根據(jù)GenBank公布的α-醇溶蛋白基因編碼區(qū)兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，引物序列為P1：5’-ATGAAGACCTTTCTCATCCTT-3’、P2：5’-GTTAGTACCGAAGATGCCAAATG-3’，將pUC57-α-gliadin轉(zhuǎn)化至DH5α，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌。以陽(yáng)性菌為模板進(jìn)行PCR鑒定，以不含目的基因的DH5α為對(duì)照組，PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）檢測(cè)鑒定后送測(cè)序公司進(jìn)行DNA測(cè)序，采用NCBI在線BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用DNAMAN軟件翻譯DNA序列。

1.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)目的序列完整編碼區(qū)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)表達(dá)引物P3：5’-CGCCATATGGTTAGAGTT CCAGTGCCA-3’、P4：5’-CCGCTCGAGGTTAGTACCG AAGATGCCAAATG-3’，在上游引物P3、下游引物P4的5’端分別引入酶切位點(diǎn)Nde I和Xho I，以陽(yáng)性質(zhì)粒為模板擴(kuò)增并回收目的基因。PCR產(chǎn)物于1% SDS-PAGE檢測(cè)后回收，回收的PCR產(chǎn)物及pET-22b（+）質(zhì)粒分別用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切片段經(jīng)純化回收，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 融合蛋白的表達(dá)和純化

陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-22b-α-gliadin轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌E. coli BL21（DE3）中，挑取單菌落接種在5 mL LB培養(yǎng)液中（含100 μg/mL氨芐青霉素），在37 ℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按照1∶100的比例接種于新鮮液體LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）上，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為1 mmol/L，37 ℃下培養(yǎng)18 h，20 ℃、10 000 r/min離心5 min，收集菌體，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次。取部分菌體超聲破碎處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析。根據(jù)Arentz-Hansen等[22]的方法，用預(yù)熱至60 ℃的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液重懸菌體，60 ℃下水浴2 h，菌懸液在20 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。加入上清液2 倍體積的1.5 mol/L氯化鈉溶液，4 ℃下過(guò)夜沉降α-醇溶蛋白，離心收集沉淀，透析后冷凍干燥。

1.3.4 α-醇溶蛋白脫酰胺改性

根據(jù)Liao Lan等[19]的方法，配制含0.04 mol/L檸檬酸的α-醇溶蛋白懸浮液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），在水浴鍋中常溫水化8 h后放入滅菌鍋中121 ℃濕熱脫酰胺10 min，于4 ℃、9 500 r/min離心10 min后得到上清液，在4 ℃透析24 h除去鹽離子，凍干，得到脫酰胺改性的α-醇溶蛋白。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

根據(jù)Liao Lan等[23]的方法。稱取2 mg樣品及200 mg KBr，在干燥條件下研磨至均勻，壓片，全波段掃描（4 000～400 cm－1），用PeakFit v4.12軟件去卷積和二階求導(dǎo)，分析酰胺I帶區(qū)域（1 700～1 600 cm－1）圖譜二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6 內(nèi)源性熒光掃描

根據(jù)Wu Haohao等[24]的方法，待測(cè)樣品溶于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中（1.0 mg/mL）。熒光分光光度計(jì)的測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，記錄300～400 nm波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光譜。

1.3.7 SEM觀察

SEM觀察根據(jù)李劍平[25]的方法。取干凈樣品臺(tái)，均勻貼上長(zhǎng)度為3～4 mm的導(dǎo)電膠，粘取少量固體粉末涂抹在導(dǎo)電膠上。將樣品臺(tái)放入噴金儀器的真空室，開(kāi)啟真空泵抽真空。待壓力達(dá)到2～4 Pa時(shí)開(kāi)始噴金。電流為20 mA，時(shí)間為40 s。將樣品臺(tái)放入儀器真空室抽真空，待壓力適宜后打開(kāi)鎢燈絲電源，開(kāi)始觀察。

1.3.8 脫酰胺改性α-醇溶蛋白對(duì)面條質(zhì)地影響的測(cè)定

根據(jù)劉國(guó)娟[15]和王靈昭[26]等的方法并作適當(dāng)調(diào)整，分別在10 g面粉中添加20 mg脫酰胺改性和未改性α-醇溶蛋白，攪拌均勻后加入5.0 mL蒸餾水揉成面團(tuán)，再制成面條，以未加入α-醇溶蛋白的面條作為對(duì)照，測(cè)定質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）指標(biāo)。每次將3 根面條水平放置在載物臺(tái)上，每個(gè)樣品做6 組平行實(shí)驗(yàn)。質(zhì)構(gòu)儀設(shè)定參數(shù)為：輕型刀片探頭；Compress模式；測(cè)試前速率0.8 mm/s，測(cè)試速率0.8 mm/s，測(cè)試后速率1 mm/s；測(cè)試距離為樣品75%厚度；感應(yīng)力為Auto-5 g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，而且重復(fù)2～3 次；樣品的測(cè)定均重復(fù)3～5 次，結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0軟件中LSD多維分析法進(jìn)行方差和顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.0軟件作圖。PCR結(jié)果用Image lab軟件進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pUC57-α-gliadin轉(zhuǎn)化及同源性分析結(jié)果

圖1 pUC57-α-gliadin轉(zhuǎn)化的平板藍(lán)白斑Fig. 1 Clones shown as blue or white plaques on a plate

由圖1可以看出，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖苷、IPTG和含氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上有明顯的藍(lán)白斑單菌落，可以初步判斷pUC57-α-gliadin成功轉(zhuǎn)化到了DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)1.0% SDS-PAGE檢測(cè)，由圖2可以看出，泳道4、8、9在860 bp處出現(xiàn)了PCR產(chǎn)物，證明其為陽(yáng)性克隆子。測(cè)序結(jié)果采用NCBI在線BLAST進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如表1所示，實(shí)驗(yàn)所用α-gliadin序列廣泛存在于小麥基因組中，其最高同源性最高達(dá)到100%。

圖2 pUC57-α-gliadin PCR鑒定結(jié)果Fig. 2 Agarose electrophoresis pattern of PCR amplification products of pUC57-α-gliadin

表1 α-gliadin基因序列同源性分析Table 1 Homology analysis of α-gliadin nucleotide sequences

2.2 表達(dá)載體pET-22b-α-gliadin構(gòu)建結(jié)果

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，如圖3所示，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上可以長(zhǎng)出白色單菌落，說(shuō)明pET-22b-α-gliadin成功進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞并使其產(chǎn)生氨芐抗性。挑選4 個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)1.0% SDS-PAGE檢測(cè)，由圖4可以看出，泳道1～4在800 bp處出現(xiàn)目的片段。雙酶切結(jié)果（圖5）和測(cè)序結(jié)果證明其為陽(yáng)性克隆子。

圖3 pET-22b-α-gliadin的轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig. 3 Transformation of plasmid pET-22b-α-gliadin

圖4 pET-22b-α-gliadin陽(yáng)性克隆子PCR鑒定Fig. 4 Agarose electrophoresis pattern of PCR amplification products of pET-22b-α-gliadin

圖5 陽(yáng)性克隆子雙酶切鑒定Fig. 5 Agarose electrophoresis pattern of the double digested plasmid DNA

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果

用DNAMAN軟件對(duì)表達(dá)蛋白氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)，氨基酸序列如下：MVRVPVPQLQPQNPSQQQPQEQVP LVQQQQFLGQQQPFPPQQPYPQPQPFPSQQPYLQLLPF LQPQLPYSQPQPFRPQQPYPQPQPQYSQPQQPISQQQQ QQQQQQQQQQQQQQQIIQQILQQQLIPCMDVVLQQH NIVHGKSQVLQQSTYQLLQELCCQHLWQIPEQSQCQA IHNVVHAIILHQQQKQQQQPSSQVSFQQPLQQYPLGQ GSFRPSQQNPQAQGSVQPQQLPQFEEIRNLALQTLPA MCNVYIPPYCTIAPFGIFGTNLEHHHHHH，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為32.2 kDa。從圖6中可以看出，經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液提取后，在約32.0 kDa處出現(xiàn)一條明顯的條帶，這與Arentz-Hansen等[22]的結(jié)果相似，證明經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后DE3表達(dá)出目的α-醇溶蛋白，且用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液可以提純得到目的蛋白，為下一步的實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

圖6 α-醇溶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expressed and purified α-gliadin

2.4 α-醇溶蛋白及其改性后二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

圖7 脫酰胺改性α-醇溶蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 7 Fourier transform infrared spectrum of deamidated α-gliadin

圖7 為α-醇溶蛋白經(jīng)過(guò)檸檬酸脫酰胺改性前后的傅里葉變換紅外光譜圖。對(duì)α-醇溶蛋白的酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）帶進(jìn)行分峰處理，能夠得到5 種蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰（1 604、1 635、1 652、1 679、1 693 cm－1）。

從表2可知，經(jīng)過(guò)檸檬酸脫酰胺改性后α-醇溶蛋白的α-螺旋含量由39.80%下降至33.50%，同時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)含量由39.50%上升為52.30%，增加顯著，而β-轉(zhuǎn)角含量則從20.70%下降為15.40%。龍偉等[27]指出：蛋白質(zhì)α-螺旋和β-折疊是存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部的穩(wěn)定規(guī)則結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角較多地暴露在蛋白質(zhì)表面，這使得抗體比較易于和β-轉(zhuǎn)角嵌合，其成為抗原表位的可能性也隨之提高；脫酰胺改性后α-醇溶蛋白的β-轉(zhuǎn)角含量下降，說(shuō)明其成為抗原表位的可能性降低，因此降低α-醇溶蛋白的致敏性。α-螺旋的結(jié)構(gòu)比較緊密且穩(wěn)定，這不利于蛋白展現(xiàn)良好的功能特性所需要的構(gòu)象變化[28]。β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的緊密程度較差且構(gòu)象穩(wěn)定性也比α-螺旋結(jié)構(gòu)差，但是它可以改善蛋白質(zhì)的柔韌性，有利于蛋白質(zhì)一些功能特性的發(fā)揮。α-螺旋/β-折疊的值反映了蛋白質(zhì)分子柔韌性，比值小則蛋白質(zhì)柔韌性高[29]。表2顯示α-醇溶蛋白經(jīng)過(guò)檸檬酸脫酰胺改性后，α-螺旋/β-折疊由1.00降為0.64，說(shuō)明檸檬酸脫酰胺改性提高了α-醇溶蛋白分子柔性。

表2 脫酰胺改性α-醇溶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化Table 2 Secondary structure composition of deamidated α-gliadin

2.5 α-醇溶蛋白及其改性后內(nèi)源性熒光變化

圖8 脫酰胺改性α-醇溶蛋白內(nèi)源性熒光掃描圖Fig. 8 Endogenous fluorescence spectrum of deamidated α-gliadin

內(nèi)源性熒光光譜主要由色氨酸殘基環(huán)境極性的變化確定，是監(jiān)測(cè)溶液中蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)在界面處構(gòu)象變化的靈敏方法[29]。如圖8所示，經(jīng)過(guò)檸檬酸脫酰胺改性后，改性α-醇溶蛋的λmax從351.5 nm移動(dòng)到355.3 nm，λmax向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，這是由于經(jīng)脫酰胺處理后的蛋白結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，使內(nèi)源色氨酸基團(tuán)暴露在溶劑中，色氨酸殘基周圍的微環(huán)境極性增強(qiáng)。說(shuō)明脫酰胺處理有利于α-醇溶蛋白構(gòu)象的展開(kāi)。

2.6 SEM觀察結(jié)果

醇溶蛋白是只含有分子內(nèi)二硫鍵的單體蛋白質(zhì)，由于沒(méi)有亞基結(jié)構(gòu)和分子間二硫鍵，醇溶蛋白肽鏈之間通過(guò)氫鍵、疏水鍵和分子內(nèi)二硫鍵連結(jié)，形成緊密的三維結(jié)構(gòu)而呈球形[30]。圖9a中α-醇溶蛋白呈顆粒狀或球形，表面粗糙重疊在一起。圖9b中可以看出α-醇溶蛋白經(jīng)過(guò)檸檬酸濕熱脫酰胺改性后，形成表面光滑均勻的塊狀。說(shuō)明脫酰胺改性對(duì)α-醇溶蛋白作用效果非常明顯，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了劇烈的變化。

圖9 脫酰胺改性α-醇溶蛋白SEM掃描圖Fig. 9 SEM photomicrographs of deamidated α-gliadin

2.7 α-醇溶蛋白及其脫酰胺改性后對(duì)面團(tuán)質(zhì)地的影響

為進(jìn)一步探究檸檬酸脫酰胺改性α-醇溶蛋白對(duì)面條質(zhì)地的影響，利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定了添加α-醇溶蛋白和檸檬酸脫酰胺改性的α-醇溶蛋白的面團(tuán)制成面條的TPA指標(biāo)，以期對(duì)脫酰胺改性α-醇溶蛋白的應(yīng)用提供參考。

表3 脫酰胺改性α-醇溶蛋白對(duì)面條質(zhì)地的影響Table 3 Effect of deamidated α-gliadin on textural properties of noodles

如表3所示，總體而言，添加了α-醇溶蛋白的面條除了黏著性由（396.34±3.57）g·s降為（264.30±7.95）g·s外，對(duì)于其他參數(shù)，α-醇溶蛋白的添加影響有限。而對(duì)于添加了檸檬酸脫酰胺改性α-醇溶蛋白的面條，其硬度由（6 941.31±3.76）g下降為（6 063.64±4.88）g，黏著性提高至（486.71±6.59）g·s，同時(shí)，面條的膠著性下降了534.39 g，咀嚼性下降了637.16 g，降幅明顯；而面條的彈性、黏聚性以及回復(fù)性則沒(méi)有發(fā)生太大變化。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)檸檬酸脫酰胺改性后，α-醇溶蛋白會(huì)提高面條的黏性而降低面條硬度，對(duì)于彈性的影響較小。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外表達(dá)、分離純化得到小麥α-醇溶蛋白，研究了在檸檬酸濕熱脫酰胺處理10 min后小麥α-醇溶蛋白的分子結(jié)構(gòu)的變化，以及改性后對(duì)面條質(zhì)地的影響，主要得出以下結(jié)論：1）經(jīng)過(guò)檸檬酸脫酰胺改性后，α-醇溶蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量增加，α-螺旋/β-折疊下降，說(shuō)明α-醇溶蛋白的分子柔性得到提高，有利于α-醇溶蛋白相關(guān)功能特性的發(fā)揮。2）脫酰胺改性后α-醇溶蛋白內(nèi)源色氨酸暴露，蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，SEM觀察結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明脫酰胺改性使α-醇溶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化。3）TPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫酰胺改性α-醇溶蛋白可以顯著提高面條的黏性而降低面條硬度，為α-醇溶蛋白的應(yīng)用提供理論依據(jù)。以上結(jié)果表明，利用檸檬酸對(duì)α-醇溶蛋白進(jìn)行脫酰胺改性改善了α-醇溶蛋白的功能性質(zhì)，具有一定的理論價(jià)值和實(shí)際意義，可為開(kāi)展α-醇溶蛋白致敏性研究提供參考。