王嬌嬌，王巧華,2,*，馬美湖，王 彬

雞蛋呼吸強(qiáng)度是表征雞蛋品質(zhì)的因素之一。雞蛋生產(chǎn)后，通過蛋殼擴(kuò)散的二氧化碳的量與雞蛋品質(zhì)直接相關(guān)[1]，故研究雞蛋呼吸作用對(duì)雞蛋品質(zhì)保鮮具有重要意義。

蛋殼是雞蛋進(jìn)行呼吸作用的介質(zhì)，它的各層超微結(jié)構(gòu)是外界環(huán)境與蛋殼內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交流的重要屏障。蛋殼由內(nèi)向外分為：蛋殼膜、乳突層、柵欄層、垂直晶體層以及表皮層共5 個(gè)部分。蛋殼的各層結(jié)構(gòu)在呼吸過程中各司其職，層與層之間含有相互連接的孔隙通道[2]，雞蛋主要通過這些孔隙進(jìn)行氣體交換[3-4]；同時(shí)，這些橫穿蛋殼的氣孔在胚胎發(fā)育過程中有利于氣體和水分的交換[5-6]。乳突單元個(gè)體間相互靠近，限制了柵欄層晶體的橫向生長，柵欄層便形成于兩個(gè)乳突單元的融合點(diǎn)，因此，若乳突單元停止生長，潛在的乳突層厚度也因此而降低[7-8]。所以乳突層對(duì)于蛋殼抗裂紋擴(kuò)展具有關(guān)鍵作用，乳突單元的緊密性和排列整齊程度會(huì)影響蛋殼裂紋的擴(kuò)展速度與方向[9-10]，因此乳突層厚度越大，對(duì)內(nèi)部破壞越大[2,11]，同時(shí)平均乳突大小與氣孔數(shù)量存在較高的相關(guān)性[12]。此外，蛋殼表層直接與外界接觸，直接影響氣體交換量，其超微結(jié)構(gòu)起著重要作用[13-15]。因此，研究蛋殼各層超微結(jié)構(gòu)對(duì)雞蛋呼吸強(qiáng)度的影響具有重要科學(xué)價(jià)值。

目前有關(guān)雞蛋呼吸作用的研究大多數(shù)集中于胚胎孵化過程中呼吸作用對(duì)孵化率的影響。研究表明呼吸作用對(duì)胚胎孵化前期[16]、中期[17-18]、后期[19]具有重要影響。佘永新等[20]在雞蛋孵化早期、后期輸氧，發(fā)現(xiàn)氧氣體積分?jǐn)?shù)達(dá)到24%時(shí)，能夠提高孵化率30%，該研究表明胚胎呼吸對(duì)雞蛋孵化率具有重要影響，同時(shí)也得出蛋殼厚度與呼吸強(qiáng)度有一定的關(guān)聯(lián)；Meir等[21]指出蛋殼是禽類胚胎發(fā)育過程中氣體交換以及水分蒸發(fā)的場(chǎng)所。然而有關(guān)蛋殼各層超微結(jié)構(gòu)對(duì)呼吸強(qiáng)度影響的研究少之又少。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)呼吸作用較大的蛋殼表面結(jié)構(gòu)較粗糙[22-23]，本研究在此基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究。本實(shí)驗(yàn)中，主要通過測(cè)量雞蛋與外界交換CO2的量計(jì)算呼吸強(qiáng)度，利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察蛋殼外表面、內(nèi)表面以及斷面，并獲取相關(guān)參數(shù)，研究蛋殼厚度、有效層厚度、乳突層厚度、平均乳突大小以及孔隙度對(duì)雞蛋呼吸強(qiáng)度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮海蘭粉殼雞蛋由武漢九峰雞場(chǎng)提供。選擇蛋殼潔凈的100 枚雞蛋作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象并進(jìn)行編號(hào)（多余備用）。將實(shí)驗(yàn)雞蛋放在培養(yǎng)箱下貯存待測(cè)（溫度為22 ℃，相對(duì)濕度為70%）。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；JY3002稱質(zhì)量儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SY-1022呼吸測(cè)定儀 石家莊世亞科技有限公司；JFC-1600離子濺射裝置、JSM-6390 LV SEM 日本NTC公司。

1.3 方法

1.3.1 呼吸強(qiáng)度測(cè)定方法

呼吸測(cè)定儀校準(zhǔn)完成后，將樣本稱質(zhì)量，記錄質(zhì)量m，放入2 L的呼吸室中，將蓋子蓋好密封，記錄此時(shí)的CO2的質(zhì)量濃度ρ0，溫度T0，測(cè)量一段時(shí)間后，記錄此時(shí)的CO2質(zhì)量濃度為ρ，溫度T以及測(cè)量時(shí)間t。根據(jù)公式（1）[24]計(jì)算呼吸強(qiáng)度Q。

式中：ρ為CO2最終質(zhì)量濃度/（mg/L）；ρ0為CO2初始質(zhì)量濃度/（mg/L）；T為最終溫度/℃；T0為最初溫度/℃；V為容器體積/L；t為測(cè)量時(shí)間/h；m為樣本質(zhì)量/g。

1.3.2 蛋殼SEM圖像的獲取

將測(cè)量完呼吸強(qiáng)度后的雞蛋打破，去除蛋黃和蛋白，清洗蛋殼并干燥。蛋殼的尖端、赤道以及鈍端都存在著孔隙，因?yàn)殁g端的孔隙相對(duì)較多，對(duì)雞蛋的呼吸影響最大，所以選取蛋殼鈍端為實(shí)驗(yàn)樣品，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氫氧化鈉溶液煮沸蛋殼15 min，去除蛋殼膜，室溫晾干備用。每個(gè)樣品取鈍端一塊大的蛋殼，外表面向上，拇指輕按，使其碎成小塊，分別選取外表面、內(nèi)表面及斷面粘于樣品臺(tái)上。采用JFC-1600離子濺射裝置進(jìn)行噴金處理約20 min。用JSM-6390 SEM，依次掃描樣品臺(tái)上的蛋殼外表面、內(nèi)表面以及斷面，分別放大2 500、100、200 倍，獲取圖像并保存。

1.3.3 蛋殼表面SEM圖像的處理

由于受到噪聲影響，蛋殼表層的超微結(jié)構(gòu)圖像會(huì)出現(xiàn)圖像模糊、邊緣陰影以及亮度不均勻等問題，使得孔隙識(shí)別困難，必須進(jìn)行必要的圖像處理（圖1）。

圖1 圖像處理Fig. 1 Image processing

本實(shí)驗(yàn)利用MATLAB軟件進(jìn)行圖像處理，圖像經(jīng)過中值濾波、閉運(yùn)算、二值化等處理得到圖1b，去除最小面積得到圖1c，再經(jīng)標(biāo)記孔隙得圖1d。圖像總像素點(diǎn)為圖像的總面積S，標(biāo)記面積為孔隙面積S’。蛋殼孔隙度H利用公式（2）計(jì)算。

1.3.4 其他參數(shù)獲取

圖2 測(cè)定平均乳突大小的SEM圖Fig. 2 SEM micrograph for the determination of the average size of mammillary cones

根據(jù)蛋殼斷面的SEM圖像得出蛋殼的厚度、乳突層厚度、有效層厚度（蛋殼厚度－乳突層厚度）。如圖2所示，平均乳突大小R＝L/n（n為乳突個(gè)數(shù)；L為二維圖片對(duì)角線的長度）[25-26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2007和SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)雞蛋呼吸強(qiáng)度的數(shù)據(jù)分析將其分為呼吸強(qiáng)度弱（≤1 mg/（kg·h））、中（＞1 mg/（kg·h））～＜3 mg/（kg·h））、強(qiáng)（≥3 mg/（kg·h））3 個(gè)等級(jí)，通過SPSS軟件中的Duncan氏多重比較法對(duì)不同呼吸強(qiáng)度類別（弱、中、強(qiáng)）的蛋殼厚度、有效層厚度、乳突層厚度以及平均乳突大小進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)形式為 ±s，P＜0.05表示差異顯著。利用Pearson分析研究確定雞蛋呼吸強(qiáng)度與蛋殼厚度、有效層厚度、乳突層厚度、乳突平均大小以及孔隙度之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋殼厚度、有效層厚度與呼吸強(qiáng)度的關(guān)系

不同呼吸強(qiáng)度的雞蛋之間蛋殼超微結(jié)構(gòu)參數(shù)顯著性分析如表1所示。蛋殼超微結(jié)構(gòu)參數(shù)與呼吸強(qiáng)度相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示。

蛋殼厚度和有效層厚度均對(duì)雞蛋呼吸強(qiáng)度具有重要影響作用。在本研究中，蛋殼厚度最大（（326.20±23.96）μm）的雞蛋具有最小的呼吸強(qiáng)度，呼吸強(qiáng)度與蛋殼厚度具有顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）（表3）。究其原因，由于蛋殼氣孔的總面積與氣孔長度存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，而氣孔的長度大致與蛋殼厚度相近[27-28]，故蛋殼過厚會(huì)增加氣孔長度，從而影響雞蛋與外界進(jìn)行氣體交換，阻礙水蒸氣減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋殼厚的雞蛋比蛋殼薄的呼吸強(qiáng)度弱，結(jié)合圖3與呼吸強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果可知，蛋殼厚度為284.75 μm的呼吸強(qiáng)度是2.86 mg/（kg·h），蛋殼厚度為316.2 μm的呼吸強(qiáng)度卻是0.84 mg/（kg·h）。

表1 不同呼吸強(qiáng)度的雞蛋之間蛋殼超微結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Ultrastructural parameters of eggshells with different respiratory intensities

表2 蛋殼超微結(jié)構(gòu)參數(shù)與呼吸強(qiáng)度相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of eggshell ultrastructural parameters and respiration intensity

圖3 不同呼吸強(qiáng)度的蛋殼厚度比較Fig. 3 Comparision of eggshell thickness with different respiration intensities

蛋殼厚度與有效層厚度之間存在密切的聯(lián)系，并且兩者間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.92，P＜0.01）（表2），這與Liao等[26]的研究相似。有效層厚度與呼吸強(qiáng)度存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R＝－0.39，P＜0.05）（表2）。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可從結(jié)構(gòu)上來分析，蛋殼的有效層與乳突層直接相連，有效層厚度直接影響孔隙的延展速度與方向，所以蛋殼有效層厚度越大，孔隙的延展速度越小，從而減少了雞蛋與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的有效通道。

2.2 乳突層厚度、平均乳突大小與呼吸強(qiáng)度的關(guān)系

在對(duì)呼吸強(qiáng)度影響因素的研究中，雖然乳突層厚度影響較小，但平均乳突大小對(duì)雞蛋呼吸強(qiáng)度具有顯著的影響（表1）。在本研究中，呼吸強(qiáng)度強(qiáng)和弱的蛋殼平均乳突大小之間具有顯著性差異（表1），平均乳突大小與呼吸強(qiáng)度存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.57，P＜0.01）（表2）。

圖4 不同呼吸強(qiáng)度的乳突平均大小比較Fig. 4 Comparision of the average size of mammillary cones with different respiratory intensities

結(jié)合圖4與呼吸強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果可以看出，平均乳突大小為101.56的呼吸強(qiáng)度是2.25 mg/（kg·h），平均乳突大小為77.38的呼吸強(qiáng)度是0.79 mg/（kg·h），由此表明，平均乳突大小越小的雞蛋呼吸強(qiáng)度越小，在蛋殼形成過程中，乳突單元之間的縫隙向內(nèi)對(duì)應(yīng)乳突底部與柵欄層的交界處形成氣孔通道。因此，若平均乳突大小值小，即單位面積內(nèi)乳突個(gè)數(shù)少，也就減少了有效氣孔通道條數(shù)，從而降低了與外界氣體交換能力。

2.3 孔隙度與呼吸強(qiáng)度的關(guān)系

蛋殼的表面層是最外面的部分，主要由鈣鹽組成，結(jié)構(gòu)連續(xù)，并且分布著很多微小的裂隙和氣孔，即孔隙?？紫妒请u蛋與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的通道。孔隙度是蛋殼單位面積內(nèi)的孔隙面積大小，孔隙度在一定程度上可以表征蛋殼內(nèi)部與外界交換通道的多少。本研究發(fā)現(xiàn)，呼吸強(qiáng)度與蛋殼孔隙度具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.66，P＜0.01）（表2）。

結(jié)合圖5與呼吸強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果可知，呼吸強(qiáng)度大的蛋殼表面比呼吸強(qiáng)度小的表面粗糙。另外，孔隙度與蛋殼厚度、有效層厚度以及乳突厚度均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與平均乳突大小存在顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.64，P＜0.05）（表2）。由于乳突層對(duì)蛋殼抗裂紋擴(kuò)展性起到關(guān)鍵作用，裂紋的擴(kuò)展速度與乳突單元大小、緊密性以及排列是否整齊有關(guān)，所以孔隙度的大小與平均乳突大小具有密切關(guān)系。

圖5 不同呼吸強(qiáng)度的蛋殼表面比較Fig. 5 Comparision of eggshell surface with different respiration intensities

此外，各層超微結(jié)構(gòu)之間也存在相互關(guān)系，蛋殼厚度與有效層厚度存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，有效層厚度是影響蛋殼厚度的一個(gè)重要因素?？紫抖扰c平均乳突大小之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié) 論

在蛋殼超微結(jié)構(gòu)中，蛋殼厚度、有效層厚度與呼吸強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)；平均乳突大小、孔隙度與呼吸強(qiáng)度呈正相關(guān)，即平均乳突大小越大、蛋殼表面的孔隙度越大、蛋殼厚度與有效層厚度越小，雞蛋的呼吸強(qiáng)度可能越大。乳突層厚度對(duì)雞蛋呼吸強(qiáng)度影響較小。此外，有效層厚度與蛋殼厚度存在極顯著正相關(guān)，表明有效層厚度與蛋殼厚度存在緊密的聯(lián)系；孔隙度與平均乳突大小存在顯著正相關(guān)，表明平均乳突大小在一定程度上影響孔隙度的大小。本研究為雞蛋呼吸作用相關(guān)研究提供了參考，同時(shí)對(duì)以后蛋殼超微結(jié)構(gòu)等研究具有一定指導(dǎo)意義。