劉慧許小龍?jiān)?/p>

1.昆山海關(guān) 江蘇昆山 215300；2.江蘇中譜檢測(cè)有限公司

普羅帕酮又名心律平，是臨床上最廣泛使用的抗心律失常藥物之一[1]，可用于預(yù)防和治療室性和室上性異位搏動(dòng)、室性或室上性心動(dòng)過(guò)速、預(yù)激綜合征、電復(fù)律后室顫發(fā)作等，起效快，作用持久[2]。然而，該藥血藥濃度與劑量呈非線性關(guān)系，且個(gè)體差異較大，劑量增加3倍血藥濃度可增加10倍，增量時(shí)應(yīng)特別謹(jǐn)慎，最好能監(jiān)測(cè)血藥濃度，如過(guò)量使用可能導(dǎo)致中毒甚至死亡[3]。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)血液中普羅帕酮的濃度對(duì)于臨床診斷與治療有著重大意義。

目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的滴定法[4]、電化學(xué)法[5-6]、分光光度法[7]、熒光光譜法[8]等在鹽酸普羅帕酮原藥、片劑及注射液等基質(zhì)較為簡(jiǎn)單的樣品檢測(cè)中應(yīng)用較多；而對(duì)于血液樣品的測(cè)定，由于其基質(zhì)復(fù)雜，干擾物多，測(cè)定前需要將樣品中的普羅帕酮與其他干擾物分離，因此測(cè)定血液中普羅帕酮的濃度，較多的采用色譜法及色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。傳統(tǒng)的液相色譜法[9-11]一般采用紫外檢測(cè)器，根據(jù)吸光度定量，該方法技術(shù)成熟、通用性好、靈敏度高，在普羅帕酮的測(cè)定中有一定應(yīng)用，但在定性能力上稍差一些；由于質(zhì)譜可以提供部分結(jié)構(gòu)信息，在定性方面有一定的優(yōu)勢(shì)，因此，采用液相色譜-質(zhì)譜法[2]測(cè)定血液中普羅帕酮的濃度，抗干擾能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的液相色譜法。然而，單級(jí)質(zhì)譜一般只能提供分子量，多級(jí)質(zhì)譜能提供更多的結(jié)構(gòu)信息以辨別假陽(yáng)性數(shù)據(jù)，采用多級(jí)質(zhì)譜能更有效地去除基質(zhì)的干擾，保證痕量物質(zhì)分析的準(zhǔn)確性。本研究直接對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的血液樣品進(jìn)行提取，通過(guò)對(duì)樣品提取、質(zhì)譜條件等進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血液樣品中痕量普羅帕酮濃度的簡(jiǎn)便方法。該方法取樣量少，適合血液樣品的取樣特殊性；準(zhǔn)確性好，能有效去除血液樣品基質(zhì)的干擾；靈敏度高，可準(zhǔn)確測(cè)定痕量普羅帕酮的濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀、TSQ Quantum MS三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀 （賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），配加熱電噴霧離子源（HESIⅡ）；高速離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；MVM-200多管漩渦混合儀（深圳祥申科技有限公司）；普羅帕酮粉末標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：54063-53-5，純度 99.5%，德國(guó)Sigma）；甲醇、甲酸（色譜純，美國(guó)天地有限公司）；采用兔血加標(biāo)模擬血液樣品。

普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：稱取普羅帕酮10 mg于100 mL容量瓶中，加入含90%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇的水溶液完全溶解后定容至刻度，充分混合即得普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A；移取1 ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A于100 mL量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合即得普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B；移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B于100 mL量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合即得普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液C；分別移取 0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 C至5個(gè)10 mL容量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合得一組普羅帕酮質(zhì)量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000 pg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，移取2.3 mL濃度為100 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至10 mL容量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合得普羅帕酮濃度為23 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Phenomenex C18 （4.6 mm×100 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為含0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）甲酸水溶液，梯度洗脫條件：0～1 min：10%～50%A；1～2 min：50%A；2～3 min：50%～96%A；3～6 min：96%A；6～6.01 min：96%～100%A；6.01～7 min：100%A；流速 0.6 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫 25℃。

質(zhì)譜條件：HESIⅡ；正離子掃描模式；質(zhì)譜掃描模式為選擇離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；噴霧電壓2.5 kV；毛細(xì)管溫度 350℃，離子源溫度 400℃，鞘氣（N2）流速 4 Arb（熱電專(zhuān)用單位），輔助氣（N2）流速 10 Arb。優(yōu)化碰撞能量，根據(jù)離子信號(hào)強(qiáng)弱選擇定性離子和定量離子，詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表1，普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

表1 普羅帕酮的質(zhì)譜主要參數(shù)

圖1 普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)譜圖

1.3 試驗(yàn)方法

取血液樣品50 μL，加入100 μL水，渦旋混勻1 min；加入甲醇定容至1 mL，自動(dòng)渦旋儀2 500 rpm渦旋10 min；離心1 500 rpm，4 min；取上清液過(guò)0.45 μm尼龍濾膜；進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 提取溶劑

將目標(biāo)化合物從樣品中提取出來(lái)是檢測(cè)的首要步驟，提取溶劑的提取效率會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。配制濃度為500 pg/mL的普羅帕酮樣品溶液，試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙醚等幾種常用溶劑對(duì)該樣品溶液的提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，4種提取溶劑中，甲醇和乙腈對(duì)血液中普羅帕酮的提取效果較好?？紤]到乙腈毒性較甲醇大，價(jià)格也相對(duì)較高，從經(jīng)濟(jì)環(huán)保的角度出發(fā)，實(shí)際檢測(cè)選擇甲醇較為合適。

圖2不同提取溶劑對(duì)血液中普羅帕酮提取效率的影響

2.2.2 提取時(shí)間

試驗(yàn)考察了提取時(shí)間分別為1、3、5、10 min時(shí)，提取率與提取時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，提取時(shí)間從1 min增加至10 min，提取率并無(wú)明顯變化，說(shuō)明提取劑對(duì)普羅帕酮的提取速率較快，1 min內(nèi)已達(dá)到平衡。因此，試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為1 min，這也縮短了樣品前處理時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)血液中普羅帕酮提取效率的影響

2.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)考察了純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.5%的甲酸水溶液作水相流動(dòng)相，甲醇作有機(jī)相時(shí)，對(duì)普羅帕酮色譜峰的影響。結(jié)果表明，幾種不同的水相流動(dòng)相對(duì)峰形影響不大，但峰面積有一定差異，具體見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，0.1%甲酸水溶液作為水相流動(dòng)相時(shí)峰面積比純水作為流動(dòng)相大，可能是由于甲酸的加入提高了離子化效率；隨后，甲酸濃度增加至0.2%及0.5%，峰面積卻隨之下降，可能是由于甲酸濃度高了競(jìng)爭(zhēng)電荷能力變強(qiáng)導(dǎo)致信號(hào)下降。因此，試驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液作為水相流動(dòng)相。

圖4流動(dòng)相中甲酸溶液的濃度對(duì)普羅帕酮色譜峰的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定下限

以10倍信噪比估算，得到普羅帕酮的測(cè)定下限460pg/mL。按儀器工作條件測(cè)定濃度為23、100、200、500、1 000、2 000 pg/mL的普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作校準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：普羅帕酮的質(zhì)量濃度在23～2 000 pg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=107.6x+423.1，相關(guān)系數(shù)為0.9996。

2.4 精密度和回收率試驗(yàn)

取3個(gè)血液樣品按試驗(yàn)方法進(jìn)行精密度和回收率試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表3，加標(biāo)回收率在95.79%～98.11%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.89%～2.4%之間，表明該檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本工研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血液樣品中的痕量普羅帕酮，該方法可直接針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的血液樣品進(jìn)行，取樣量少、樣品前處理簡(jiǎn)單快速、干擾少、測(cè)定下限低、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。