王立娜，王家林，朱濤，呂雪峰

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藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究進展與展望

王立娜1,2，王家林1，朱濤2，呂雪峰2

1 青島科技大學 海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042 2 中國科學院青島生物能源與過程研究所 中國科學院生物燃料重點實驗室，山東 青島 266101

王立娜, 王家林, 朱濤, 等. 藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究進展與展望. 生物工程學報, 2018, 34 (9): 1386–1397.Wang LN, Wang JL, Zhu T, et al. Progress and perspectives on cyanobacterial ploidy. Chin J Biotech, 2018, 34 (9): 1386–1397.

藍細菌是一類古老的光合原核微生物。就基因組拷貝數(shù) (倍性) 而言，藍細菌是原核生物中基因組低、中、高拷貝共存的典型類群之一，而基因組多拷貝特性是制約藍細菌高效遺傳改造的瓶頸。已有研究表明，藍細菌的基因組拷貝數(shù)表現(xiàn)出生長周期的依賴性并受多種遺傳、環(huán)境因子的影響。文中綜述了藍細菌基因組拷貝數(shù)的國內(nèi)外最新研究進展、分析方法及影響因素，并討論了藍細菌基因組多拷貝研究的環(huán)境生態(tài)和生物技術意義。最后，對未來藍細菌基因組拷貝數(shù)相關的研究方向作出展望。

藍細菌，基因組拷貝數(shù)，理化因子，細胞工廠

生物基因組的拷貝數(shù)，在真核生物中稱之為倍性 (Ploidy)，指細胞核中所含有的染色體組 () 的套數(shù)。正常的配子細胞中所包含的染色體數(shù)稱為一套單倍染色體 (單倍體，Haploid)，用符號表示。具有兩個染色體組的細胞或個體稱為二倍體 (2，Diploid)，具有兩個以上整套染色體組的細胞或個體則稱為多倍體 (Polyploid)，包括三倍體 (3，Triploid)、四倍體 (4，Tetraploid) 等。

在自然界中，許多真核生物如纖毛蟲、兩棲動物、魚類、開花植物等，都是多倍體生物[1]。受早期大腸桿菌 (，革蘭氏陰性菌)[2]和枯草芽胞桿菌 (，革蘭氏陽性菌)[3]等模式生物相關研究的影響，傳統(tǒng)觀點認為原核生物僅有一個基因組拷貝，其基因組單拷貝特征在文獻中也稱之為單倍性 (Monoploidy)[1]。但是，近年來對細菌最大的類群——變形菌門 (Proteobacteria) 的分析發(fā)現(xiàn)，涵蓋其α-、β-、γ-、δ-、ε-變形桿菌綱的多數(shù)菌株并非只擁有單個拷貝的基因組[4]。大腸桿菌 (γ-變形桿菌綱) 在最優(yōu)培養(yǎng)條件下快速生長時，其胞內(nèi)也可含有多個復制起始位點。這里需要指出的是，原核生物的基因組多拷貝現(xiàn)象，在許多文獻中也稱之為“多倍性” (Polyploidy)，但是此處的Polyploidy是與原核生物的寡倍性 (Oligoploidy，數(shù)個基因組拷貝)、單倍性 (Monoploidy，單個基因組拷貝) 相呼應的概念，與真核生物的多倍性所表達的生物學意義并不相同。通常中文表述中所指的原核生物的倍性即細胞所含有的基因組DNA的拷貝數(shù)。

原核生物界還有另外一個大的類群叫作藍細菌 (Cyanobacteria)，其細胞壁具有革蘭氏陰性菌特征，由內(nèi)外兩層構成，外層為外膜，由外側的脂多糖層和內(nèi)側的磷脂層構成，內(nèi)層為肽聚糖，許多藍細菌還可分泌膠狀物質，在細胞群體或絲狀體外形成膠被。藍細菌的膜系統(tǒng)包括細胞膜和類囊體膜，細胞膜包裹細胞質，細胞質內(nèi)有平行或卷曲方式分布的類囊體膜結構，是光合作用發(fā)生的場所。與其他原核生物類似，藍細菌缺乏其他膜結構的細胞器，沒有真正意義的細胞核、線粒體等[5-6]。藍細菌既是研究光合作用、碳氮固定、葉綠體進化等基礎科學問題的優(yōu)良模式生物，又是合成新型生物燃料和化學品的重要底盤細胞[7-10]。多年來，原核生物基因組多拷貝現(xiàn)象未能引起足夠的重視，而最近的研究表明藍細菌是原核生物中基因組低、中、高拷貝共存的典型類群之一[1]。

基因組多拷貝現(xiàn)象可能涉及多個胞內(nèi)過程，有其潛在優(yōu)勢，如全局調(diào)控基因表達、控制細胞體積、調(diào)節(jié)基因劑量、減少自發(fā)突變、輔助DNA修復等[1,11]，并且有報道指出藍細菌的基因組DNA表現(xiàn)出依賴于晝夜節(jié)律的時空分布特征[12-13]。

然而，就生物技術應用而言，基因組多拷貝則可能是制約藍細菌高效遺傳改造的潛在障礙[14]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)藍細菌的基因組拷貝數(shù)與細胞生長周期及多種理化因子相關[11]。從根本上認識藍細菌的基因組拷貝數(shù)特征并發(fā)掘其可能的影響和控制因素，還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。而以藍細菌作為研究模式解析原核生物基因組多拷貝現(xiàn)象的形成機制仍具有較為廣闊的研究空間。

本文對藍細菌基因組拷貝數(shù)的相關研究進行簡要綜述，將有助于在全局水平上認識藍細菌基因組的多拷貝現(xiàn)象，優(yōu)化依賴標簽基因頻率對微生物群落結構的評價體系，加速推動以藍細菌作為“細胞工廠”合成生物能源和高附加值化學品的進程。

1 藍細菌基因組拷貝數(shù)的相關研究

1.1 藍細菌是基因組低、中、高拷貝共存的代表性原核微生物之一

早在20世紀六、七十年代，Marvin Edelman、Rosmarie Rippka等學者就對巴斯德菌種保藏中心 (Pasteur Culture Collection，PCC) 的200多株藍細菌的基因組大小進行系統(tǒng)研究[15-17]。近年來，隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，越來越多藍細菌的基因組被測序分析，這使得對藍細菌基因組大小的整體認識變得更為全面精確[10,18]。相對而言，關于藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究卻比較匱乏?，F(xiàn)對目前已報道的關于藍細菌基因組拷貝的相關研究總結于表1。

其中聚球藻sp. WH 7805和sp. WH 8101為目前已鑒定的基因組單拷貝菌株，其余菌株的基因組均為多拷貝。細長聚球藻和sp. PCC 6301的基因組拷貝數(shù)在2?6之間，有報道稱集胞藻sp. PCC 6803等菌株的基因組拷貝數(shù)可達幾十甚至上百，而實驗室純培養(yǎng)的紅海束毛藻IMS101平均每個細胞的基因組拷貝數(shù)最高可達600多個拷貝。因此，藍細菌是基因組低、中、高拷貝共存的代表性的原核微生物類群之一。

表1 藍細菌基因組拷貝數(shù)及相關分析參數(shù)[1]

aStationary phase;bLight-dark cycles;cExponential phase/linear phase/stationary phase;dLonger doubling times correspond to lower genome copy numbers;eCalculated from relative fluorescence and genome size of PCC 6301;fField-collected samples.

1.2 藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究方法

早期對藍細菌基因組拷貝數(shù)的關注主要是為了認識其細胞分裂過程和特性，而后隨著分子生物學的興起，科學家開始發(fā)掘和改造模式藍細菌，并藉此探索光合作用、碳氮代謝和細胞分化等基礎科學問題。而基因組多拷貝時常導致一些基因不能被完全敲除，因此為深入認識藍細菌的基因組拷貝數(shù)特性，各種分析方法應運而生。近年來，代謝工程和合成生物學技術飛速發(fā)展，發(fā)展藍細菌光合“細胞工廠”，合成生物能源和高附加值化合物，精確分析其基因組復制過程和基因組拷貝數(shù)特性，則是整體提高其遺傳改造效率的必然選擇。藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究方法分述如下并總結于表2。

1.2.1 分光光度法 (Spectrophotometry)

分光光度法是較為簡單易行的分析原核生物基因組拷貝數(shù)的方法。該方法的基本原理是提取一定數(shù)量細胞的基因組DNA，利用分光光度法 (260 nm波長處的吸收峰) 對其定量 (m)，并計算其相對分子質量 (M)，結合細胞計數(shù)，可推算單位細胞的基因組拷貝數(shù) (N=NA*m/M，N為菌株基因組拷貝數(shù)，NA為阿伏伽德羅常數(shù))[1,4]。分光光度法的優(yōu)點是對設備要求低，數(shù)據(jù)分析簡單，缺點是因涉及DNA提取，因此分析通量低，要求基因組純度高、提取損失率小，且要排除RNA和內(nèi)源質粒對測試結果的影響。

德國法蘭克福大學J?rg Soppa教授實驗室曾以分光光度法證實細長聚球藻PCC 7942和聚球藻WH 7803的基因組拷貝數(shù)與早期用其他方法所得結果一致，但集胞藻PCC 6803的基因組拷貝數(shù)可高達218，與前人的報道相差較大[1]。后來該實驗室系統(tǒng)分析了集胞藻PCC 6803的6株亞株的基因組拷貝數(shù)，分光光度法所得結果與前述其實驗室報道結果仍有較大差異[11]。

1.2.2 流式細胞儀分析法 (Flow cytometry)

流式細胞儀分析法可以與DNA熒光染色結合，對單細胞進行高通量、多參數(shù)的定性定量分析。該方法首先需要確定一個合適的對照菌株 (如經(jīng)抑制劑處理后細胞處于基因組單拷貝狀態(tài)的大腸桿菌)，經(jīng)過熒光補償后，根據(jù)前向散射 (FSC)、側向散射 (SSC) 等參數(shù)，得到基因組單拷貝大腸桿菌的熒光強度值。再將目的菌株的基因組DNA染色、進樣分析，根據(jù)目的菌株熒光強度值與大腸桿菌單拷貝熒光強度值對比，計算獲得目的菌株基因組拷貝數(shù)[30]。

目前關于藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究結果多數(shù)來自流式細胞分析法。20世紀90年代，麻省理工學院Sallie W. Chisholm教授實驗室在研究聚球藻PCC 6301胞內(nèi)基因組DNA復制循環(huán)與細胞生長速率關系時，就以此方法證實該菌株的基因組拷貝數(shù)為2?6[25]。此后，該實驗室還以流式細胞法系統(tǒng)分析了4株海洋菌株的基因組拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)聚球藻WH 8101和聚球藻WH 7805為單拷貝，聚球藻WH 8103為1?2拷貝，聚球藻WH 7803為2?4拷貝[26]。日本東京農(nóng)業(yè)大學Hirofumi Yoshikawa教授實驗室建立了基于流式細胞分析的精確的藍細菌基因組DNA拷貝數(shù)的分析方法，并比較了細長聚球藻 PCC 7942光照和黑暗條件下流式細胞儀分析信號的顯著差別和基因組拷貝數(shù)的差異[30]。

1.2.3 熒光定量PCR法 (qPCR)

qPCR技術分析菌株基因組拷貝數(shù)的流程是：提取待分析菌株的完整基因組DNA，并選取1 kb左右的標準片段進行普通PCR擴增。以已知濃度的PCR產(chǎn)物作為模板進行一系列濃度梯度稀釋后，進行qPCR反應，并據(jù)其產(chǎn)物濃度和擴增特性制作標準曲線。同時，以待分析菌株基因組DNA作為模板進行濃度梯度稀釋，再進行qPCR反應以擴增其內(nèi)部300 bp左右的內(nèi)參序列，所得t值代入標準曲線，結合菌株細胞數(shù)目即可獲得該菌株的平均基因組拷貝數(shù)[1,4]。

qPCR技術是較為靈敏的測定藍細菌基因組拷貝數(shù)的技術，為保證測定結果的準確性，該方法對目標菌株基因組DNA的要求較高，需要提取方法損失小、DNA完整無斷裂且純度較高。如前述分光光度法，J?rg Soppa實驗室還以qPCR分析了各個菌株的基因組拷貝數(shù)，其實驗數(shù)據(jù)表明qPCR法和分光光度法所得數(shù)據(jù)近似[1,11]。此外，Sargent等以單拷貝固氮基因作為標準片段，以qPCR法作為分析方法，發(fā)現(xiàn)實驗室純培養(yǎng)紅海束毛藻的基因組拷貝數(shù)遠高于海洋環(huán)境樣品中同屬的其他菌株[29]。

1.2.4 熒光蛋白分子顯示系統(tǒng) (Fluorescent reporter-operator system, FROS)

熒光蛋白標記結合顯微成像技術是近年來發(fā)展起來的可以實時追蹤分析微生物基因組復制、分配動態(tài)和基因組拷貝數(shù)的方法。該方法的基本原理是基于順式作用元件和反式作用因子的結合，在目標物種基因組上插入、等的上百個串聯(lián)重復 (中間以10 bp左右的隨機序列隔開以減少同源重組)，并在目標物種胞內(nèi)表達熒光蛋白標記 (GFP、YFP等) 的LacI、TetR，在加入誘導劑的情況下，可標記目標物種的單個基因組的特定位置，并可實時分析其動態(tài)變化[31]。

熒光蛋白分子顯示系統(tǒng) (如LacO240/LacI- fluorescent protein tag、TetO240/TetR-fluorescent protein tag等) 用于分析基因組拷貝數(shù)具有極高的準確性，可同時標記基因組的復制起始位點和終止位點，因此還用于分析基因組DNA分子內(nèi)和分子間的動態(tài)變化特征[32-33]。該方法的缺點是在基因組上引入了數(shù)百個串聯(lián)重復序列，可能會擾亂DNA復制和細胞分裂，降低菌株的遺傳穩(wěn)定性，因此僅用于分析模式菌株[32-34]。

表2 藍細菌基因組拷貝數(shù)的研究方法

霍華德休斯醫(yī)學研究所的Erin K. O’Shea教授實驗室[32]和哈佛大學的Pamela A. Silver教授實驗室[33]曾分別采用熒光蛋白分子顯示系統(tǒng)分析了細長聚球藻PCC 7942的基因組拷貝數(shù)及其復制和分配特性，發(fā)現(xiàn)該菌株可含有4?6個基因組拷貝，其基因組復制不依賴于細胞分裂，具有非同步復制、嚴謹型分配的特點。

1.2.5 熒光原位雜交法 (Fluorescenthybridization, FISH)

熒光原位雜交法的原理是：將熒光素標記探針與待檢測菌株基因組DNA上特定片段雜交，經(jīng)變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。再利用熒光素與特異親和素之間的免疫化學反應，可借助熒光檢測體系在熒光顯微鏡下對目標物種基因組DNA進行定性、定量、定位分析。

FISH技術分析藍細菌基因組拷貝數(shù)的優(yōu)點是靈敏度高、不涉及復雜的遺傳操作，可與流式細胞法相結合。與FROS技術相比，其缺點是涉及固定過程，不能進行活體標記。

最近，Hirofumi Yoshikawa 實驗室以FISH技術標記了細長聚球藻PCC 7942的基因組，較全面地分析了影響其遺傳分配的相關基因[34]。

綜上所述，因藍細菌種類豐富，是基因組低、中、高拷貝共存的典型類群，甚至同一株系的不同亞株間基因組拷貝數(shù)都有較大差異。因此，對于基因組拷貝數(shù)的分析，需要上述多種方法的結合，且要借助目標菌株的其他生理生化指標，才可獲得特定菌株基因組拷貝數(shù)的概貌。而對藍細菌基因組拷貝數(shù)的準確認識，也是分析其影響因素和調(diào)控機制的必要前提。

2 藍細菌基因組拷貝數(shù)的影響因素

藍細菌作為一類古老的光合原核微生物，在進化過程中形成了低、中、高拷貝類群共存的格局，反映出其極強的環(huán)境適應能力。原核生物的基因組多拷貝現(xiàn)象被認為在真核生物有絲分裂、減數(shù)分裂以及真核生物性的起源中發(fā)揮了重要作用[35]?，F(xiàn)在已經(jīng)證明真核生物的細胞分裂由細胞周期關鍵調(diào)控因子所控制，與此不同，藍細菌細胞分裂中尚未發(fā)現(xiàn)類似的主控因子，因此，藍細菌的細胞分裂和遺傳物質分配可能是一個多維度的復雜事件。

已有研究表明藍細菌的基因組復制與細胞分裂是非同步的，高拷貝菌株集胞藻PCC 6803的基因組DNA的遺傳分配是非嚴謹型調(diào)控的，新生細胞和母代細胞所獲基因組的拷貝數(shù)具有一定的隨機性[36]。而細長聚球藻PCC 7942的基因組DNA沿其長軸與羧酶體間隔排列的特征，則被認為是完成其遺傳物質嚴謹型分配的重要保障。藍細菌基因組拷貝數(shù)伴隨細胞生長發(fā)生較大變化，并且受多種環(huán)境因子和遺傳因子的影響，下面將分別介紹。

2.1 藍細菌的基因組拷貝數(shù)表現(xiàn)出生長周期 (Growth phase) 的依賴性

德國法蘭克福大學J?rg Soppa實驗室的實驗結果顯示集胞藻PCC 6803的基因組拷貝數(shù)是高度可變的，表現(xiàn)出生長周期的依賴性，在接種初期 (750≈0.1) 其平均拷貝數(shù)均值約為20，隨著細胞生長其基因組拷貝數(shù)明顯降低，在平臺期 (750≈2.5) 均值約為4，前后相差4倍[11]。

細長聚球藻PCC 7942的基因組拷貝數(shù)也具有生長周期依賴的特點，Hirofumi Yoshikawa實驗室證實在生長停滯期 (Lag phase) 其基因組DNA復制旺盛，基因組拷貝數(shù)高于指數(shù)生長期和線性期[30]。藍細菌的整個生長周期涉及多種理化因子的參與，因此，藍細菌基因組拷貝數(shù)在不同生長階段表現(xiàn)出的巨大差別可能與此類理化因子相關。

2.2 影響藍細菌基因組拷貝數(shù)的相關環(huán)境因子

2.2.1 光照強度

光照是藍細菌生長的必需條件，已有研究表明藍細菌的基因組DNA復制也是光依賴的。Hirofumi Yoshikawa教授實驗室以細長聚球藻PCC 7942作為研究模式，深入解析了藍細菌基因組DNA復制的光依賴性。通過在野生型細長聚球藻PCC 7942中引入單純皰疹病毒來源的胸苷激酶 (Thymidine kinase, TK)，構建了外加BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) 條件下可示蹤DNA從頭合成的PCC 7942TK菌株。

進一步研究發(fā)現(xiàn)在黑暗條件下，DNA復制被阻斷，而在光照條件下，DNA復制重新開始。基因組DNA復制能否正常起始，與胞內(nèi)基因組的拷貝數(shù)息息相關。該實驗室通過流式細胞分析證實細長聚球藻PCC 7942黑暗條件下的基因組拷貝數(shù)遠小于光照[30]。

但是，J?rg Soppa教授團隊對集胞藻PCC 6803的研究結果顯示，相對于對照條件 (80 μmol photon/(m2·s))，30 μmol photon/(m2·s)低光照強度下其拷貝數(shù)提高了接近2倍[11]。有證據(jù)顯示，光照會影響基因組DNA的胞內(nèi)空間排布，在黑暗狀態(tài)下，細長聚球藻PCC 7942的基因組DNA彌散于細胞質中，在光暗循環(huán)或者持續(xù)光照條件下，其基因組DNA空間上呈現(xiàn)膨脹/壓縮交替的節(jié)律性變化[12-13]。光照引起的基因組DNA空間布局的節(jié)律性變化很可能是為即將進行的細胞分裂及基因組各拷貝的遺傳分配做準備。

此外，Yasuko Kaneko教授實驗室還通過高壓低溫電子層析成像技術捕捉到了細長聚球藻PCC 7942處于高度壓縮狀態(tài)下的基因組DNA[37]。DNA復制的光依賴性可能跟光合電子傳遞有關。線性電子傳遞可阻斷DNA復制的起始和進程，而圍繞光系統(tǒng)I的環(huán)式電子傳遞可推動已起始復制的DNA完成復制過程[38]。光照強度對藍細菌基因組拷貝數(shù)的影響機制目前還不明確，有待深入解析。

2.2.2 磷元素

磷元素是DNA的重要組成部分，多個拷貝的基因組DNA的合成需要大量磷元素的參與。對集胞藻PCC 6803的研究結果顯示，相對于標準培養(yǎng)條件 (0.13 mmol/L磷酸鹽)，高磷培養(yǎng)條件 (1.3 mmol/L磷酸鹽) 下，其平均基因組拷貝數(shù)可由27變成35，提高近1/3。而在缺磷培養(yǎng)基中，集胞藻PCC 6803的基因組拷貝數(shù)迅速降低，其生長也受到一定程度的抑制，在培養(yǎng)6 d之后培養(yǎng)液光密度維持恒定，不再增加，但是其基因組拷貝數(shù)繼續(xù)降低，最終甚至可變成單拷貝[11]。J?rg Soppa實驗室的實驗數(shù)據(jù)表明，缺磷在導致集胞藻PCC 6803基因組拷貝數(shù)僅下降5倍的同時，其細胞數(shù)目增加了近20倍。

因此，缺磷條件下細胞短期內(nèi)的生長能力與基因組拷貝數(shù)的降低幅度的差距，暗示缺磷培養(yǎng)前期，依然有基因組DNA從頭合成的進行。而這一過程中磷元素的來源可能涉及胞內(nèi)的其他含磷組分，如多聚磷酸、RNA、ATP、NADP、磷脂等[11]。

Hirofumi Yoshikawa實驗室通過分析細長聚球藻PCC 7942培養(yǎng)液的元素消耗，證實磷元素在接種96 h后即被細胞吸收完畢，是消耗最快的大量元素。而這一時期胞內(nèi)基因組拷貝數(shù)快速增加[30]；此外，他們還分析了磷元素吸收相關的雙元信號轉導組分 (和) 的轉錄情況，證實該系統(tǒng)在培養(yǎng)液磷元素含量較高的生長延滯期不表達，而在胞外磷濃度降低85%后大量表達[30]。因此，磷元素也是影響細長聚球藻PCC 7942基因組拷貝數(shù)的重要因素。

2.2.3 DNA自身作為磷、碳、氮等的貯藏物

已有研究結果表明，基因組高拷貝古菌 (如沃氏富鹽菌) 的DNA除了充當遺傳信息的載體外，富余的基因組DNA還可作為胞內(nèi)磷的貯藏體，在體內(nèi)磷元素匱乏時該古菌可降解其基因組DNA，從而維系細胞生長。

J?rg Soppa實驗室在集胞藻PCC 6803的研究發(fā)現(xiàn)，外源添加鯡魚精DNA可恢復缺磷引起的生長抑制，暗示外源DNA添加可逆轉缺磷引起的基因組拷貝數(shù)的降低。另一有趣的現(xiàn)象是該實驗室發(fā)現(xiàn)添加外源DNA還可恢復缺碳但不能恢復缺氮對集胞藻PCC 6803生長的抑制[11]。

如前所述，海洋固氮藍細菌紅海束毛藻的基因組拷貝數(shù)可達數(shù)百個，其基因組大小約為7.75 Mb，顯著特點是40%左右的序列并不行使蛋白編碼功能，且10%左右的編碼基因為重復基因。Sargent等對紅海束毛藻的研究同樣認為基因組DNA作為貯藏物可調(diào)節(jié)物種基因組拷貝數(shù)，提高物種的生態(tài)競爭能力[29]。無論自身DNA還是外源添加DNA對某一物種基因組拷貝數(shù)的影響，可能涉及DNA吸收、降解、碳氮代謝等一系列復雜的過程。在許多野外環(huán)境中，DNA結合態(tài)磷的濃度要遠高于游離無機磷酸的濃度，也從側面說明了DNA作為磷貯藏體的可能性[11]。

2.3 影響藍細菌基因組拷貝數(shù)的相關遺傳因子

在大腸桿菌.、枯草芽胞桿菌、新月丙桿菌和天藍色鏈霉菌等模式生物中，已經(jīng)鑒定了維系類核結構、基因組DNA遺傳分配、細胞分裂Z環(huán)形成等相關的多個關鍵基因，此類基因與他們新生細胞的基因組拷貝數(shù)密切相關[39]。近年來，對藍細菌相關基因和作用機制的認識也取得了一定進展?？赡苡绊懰{細菌基因組DNA遺傳分配和拷貝數(shù)的相關遺傳因子總結于表3，分述如下。

2.3.1 ParA對藍細菌基因組DNA遺傳分配的影響

ParA/MinD是微生物調(diào)節(jié)胞內(nèi)組分 (如質粒、類核、細胞分裂相關因子等) 空間排布的一類ATP酶[32,34]。細長聚球藻PCC 7942中羧酶體和類核有沿長軸交替線性排列的特點，而ParA被證實影響羧酶體的空間排布，因此，ParA參與了細長聚球藻PCC 7942的胞內(nèi)區(qū)間化調(diào)節(jié)[40]。

依賴FROS報告系統(tǒng)，Erin K. O’Shea實驗室曾認為敲除不影響基因組DNA的空間排布[33]。而最近Hirofumi Yoshikawa實驗室對進行了敲除、互補、過量表達等一系列遺傳學實驗，以熒光原位雜交技術 (FISH) 證實參與了細長聚球藻PCC 7942基因組DNA的遺傳分配[34]。并通過酵母雙雜交實驗，鑒定了與ParA互作的多個蛋白，其中3個蛋白 (Synpcc7942_2009, Synpcc 7942_2653和Synpcc7942_2045) 屬于SMC (Structural maintenance of chromosomes) 家族[34]。這些蛋白可能涉及基因組DNA的膨脹/壓縮特性，ParA對細長聚球藻PCC 7942基因組DNA遺傳分配的作用機制可能與其相關。

2.3.2 MreB對藍細菌基因組DNA遺傳分配的影響

MreB是肌動蛋白類似物，在細菌的細胞形態(tài)和基因組DNA遺傳分配中發(fā)揮重要作用。趙進東教授實驗室發(fā)現(xiàn)魚腥藻sp. PCC 7120的可被完全敲除，且僅影響細胞形態(tài)并不影響其基因組DNA的遺傳分配，魚腥藻PCC 7120的基因組DNA的遺傳分配方式可能是非嚴謹型調(diào)控的[22]。而細長聚球藻PCC 7942中僅能部分敲除，其突變株表現(xiàn)出基因組DNA的聚集現(xiàn)象，說明MreB影響了該菌株基因組DNA的遺傳分配[32,34]。

大腸桿菌和霍亂弧菌的敲除會導致“無核”細胞的產(chǎn)生，但是細長聚球藻PCC 7942中無此現(xiàn)象。因此，MreB對細長聚球藻PCC 7942基因組DNA遺傳分配的影響也可能是其影響細胞壁合成帶來的次級效應。

藍細菌基因組DNA的復制、組織和分配是個復雜的過程，對維系其基因組拷貝數(shù)至關重要。目前僅發(fā)現(xiàn)了少數(shù)影響藍細菌基因組遺傳分配的基因，且其作用機制還不清晰。但是當前研究進展證實，至少部分藍細菌基因組DNA的分配是受特定遺傳因子控制的，這為未來深入解析研究藍細菌的基因組拷貝數(shù)特征奠定了基礎。

表3 模式細菌中細胞分裂相關蛋白的分布

aBased on sequence alignment, no functional validation has been performed;bIt may involve mycelial growth rather than cell division.

3 藍細菌基因組拷貝數(shù)相關研究的環(huán)境生態(tài)學和生物技術意義

3.1 環(huán)境生態(tài)學意義

以標簽基因 (如16S rRNA基因、基因、基因、基因等) 結合高通量測序分析環(huán)境樣品的微生物組成、結構和多樣性克服了早期基于形態(tài)和培養(yǎng)方法的局限，推動了分子生態(tài)學的快速發(fā)展。當然，標簽基因頻率對微生物群落結構的映射也存在諸多的影響因素，如環(huán)境樣品DNA提取效率、PCR擴增效率、標簽基因多拷貝異質性、數(shù)據(jù)分析方法等，針對上述潛在影響因素業(yè)已發(fā)展出多種應對措施，在此不作贅述。

本文需要指出的是，環(huán)境樣品中特定物種的基因組多拷貝現(xiàn)象也是影響微生物群落結構分析的重要因素。如Soppa教授所述，當同一群落中基因組單拷貝和多拷貝的物種共存時，以標簽基因頻率為評價指標的物種多樣性分析，會大大高估基因組多拷貝物種的豐度[46]。因此，在水華、赤潮等藍細菌相關的環(huán)境生態(tài)學研究中，菌株基因組拷貝數(shù)是一個不容忽視的問題，雖然當前還不能依賴傳統(tǒng)技術對環(huán)境樣品中各物種基因組拷貝數(shù)作出準確評價，伴隨對特定生境中特色物種基因組拷貝數(shù)的深入認識，結合生物信息學手段直接預測環(huán)境樣本中不同物種的基因組拷貝數(shù)在不久的未來將會實現(xiàn)。

3.2 生物技術意義

開發(fā)藍細菌細胞工廠，發(fā)掘其光合固碳效率和生物合成潛力，需要從本質上認識藍細菌的生命過程。在細胞結構層面，藍細菌雖是原核生物，卻有著高度協(xié)調(diào)的胞內(nèi)時空組織性[12,32-33,37,45]。而要獲得性狀穩(wěn)定的基因工程菌株，直接改造其基因組DNA是最佳選擇。具有天然遺傳轉化系統(tǒng)是藍細菌作為光合細胞工廠的優(yōu)勢，但是伴隨漫長進化過程所獲得的基因組多拷貝特性，卻是高效遺傳改造藍細菌的障礙。較為矛盾的是，一旦目標合成途徑被穩(wěn)定整合到各基因組拷貝上，為提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，其合成途徑的高效表達時常又依賴于基因組DNA劑量的增加。

因此，理想的遺傳改造過程是，在外源途徑引入時盡可能降低宿主細胞的基因組拷貝數(shù)以提高同源重組和整合效率，在規(guī)?；囵B(yǎng)基因工程菌株、表達外源途徑時盡可能提高基因組拷貝數(shù)以提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量。而這一過程的實現(xiàn)，最首要的是鑒定能夠控制基因組拷貝數(shù)的遺傳和環(huán)境因子，并在基因組拷貝數(shù)可控條件下發(fā)掘提高同源重組效率的方法。如前所述，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個遺傳和環(huán)境因素影響藍細菌的基因組拷貝數(shù)[11,34]，暗示前述基于基因組拷貝數(shù)遺傳改造和擴大培養(yǎng)藍細菌的可行性。因此，認識藍細菌這一類微生物基因組拷貝數(shù)的基本特征、解析其基因組的復制和遺傳分配機制、協(xié)調(diào)其胞內(nèi)大分子聚合物的時空格局，在藍細菌生物技術利用方面具有重要意義。

4 展望

原核生物基因組多拷貝現(xiàn)象近年來被廣泛關注，進化模型分析表明，基因組多拷貝可賦予原核生物短期的進化優(yōu)勢，但是對長期進化而言，基因組多拷貝容易積累隱性有害突變和致死突變。因此，對基因組多拷貝藍細菌而言，必然有其適應策略以減少多拷貝的遺傳成本同時保留其優(yōu)勢。藍細菌家族的低、中、高拷貝特性，使其在基礎研究和生物技術應用領域均具有無可比擬的優(yōu)勢。圍繞藍細菌基因組拷貝數(shù)特征，未來研究的主體內(nèi)容可能集中在以下幾個方面：1) 基于生態(tài)學和生物信息學的藍細菌基因組拷貝數(shù)的分析和預測；2) 藍細菌多拷貝基因組的復制、分配特性，及基因組DNA的時空分布格局；3) 藍細菌基因組拷貝數(shù)的調(diào)節(jié)和控制機制；4) 基于藍細菌拷貝數(shù)調(diào)控的遺傳改造和生物合成。

建立穩(wěn)定可靠的藍細菌基因組拷貝數(shù)的評價和預測方法，獲得此類微生物基因組拷貝數(shù)的概貌，將從本質上加深對這一光合體系的認識，可為藍細菌在分子遺傳、分子生態(tài)和基因工程方面的研究提供理論基礎，必將推動綠色微型“細胞工廠”從“溫室”走向“自然”的進程。

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(本文責編 陳宏宇)

Progress and perspectives on cyanobacterial ploidy

Lina Wang1,2, Jialin Wang1, Tao Zhu2, and Xuefeng Lü2

1 College of Marine Science and Biological Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, Shandong, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Cyanobacteria are a phylum of bacteria which are believed to be the oldest photosynthetic prokaryotic microorganisms on earth. The phylogenetic group of cyanobacteria was thought to be one of the prokaryotes that contain monoploid, oligoploid and polyploid species, and one obstacle to engineering cyanobacteria is their polyploidy genome. In recent years, the ploidy level of cyanobacteria was found to be influenced by growth phase and by multiple genetic and environmental factors. In the present article, we reviewed the progress, analytical methods and influencing factors on the cyanobacterial ploidy, and discussed the significance of cyanobacterial polyploidy regarding to environmental ecology and biotechnology. Based on this observation, the future research directions in this field are prospected.

cyanobacteria, ploidy, physical and chemical factors, cell factory

December 24, 2017;

February 13, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31570068), Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics (No. SDKLEG201804).

s: Tao Zhu. Tel: +86-532-80662711; E-mail: zhutao@qibebt.ac.cn

國家自然科學基金(No. 31570068)，山東省能源生物遺傳資源重點實驗室開放基金(No. SDKLEG201804) 資助。

2018-03-06

10.13345/j.cjb.170513

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180306.0833.001.html