戴作波，姜志戎

江蘇省寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇寶應(yīng)， 225800

麝香接骨丸是該院自行研制的純中藥制劑，由紅花、血竭、麝香、丁香、骨碎補(bǔ)、自然銅、當(dāng)歸、杜仲等十五味中藥組成。有和營(yíng)活血接骨續(xù)筋功效。用于跌打損傷所致軟組織損傷、骨折脫位中后期筋肉攣痛見(jiàn)上述癥候者。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀，Waters 2998型PDA檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）。METTLER TOLEDO MS-105DU型電子分析天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）。KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。Milli-Q DIRECT8型純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

麝香接骨丸（批號(hào)：170612，170626，170701，由本院提供），羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)：111637-201609，純度91.9%，購(gòu)自于中國(guó)食品藥品研究檢定院）。甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA公司），磷酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.7%磷酸溶液（30：70）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 提取條件的考察

該方中紅花為飲片粉末入藥，因此在考察提取條件時(shí)參考2015年版《中國(guó)藥典》“紅花”項(xiàng)下的有關(guān)內(nèi)容：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率 300 W，頻率 50 kHz）40 min[1]，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

據(jù)此考察了甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水為提取溶劑，30 min、40 min、50 min 和 60 min 為提取時(shí)間[2]，對(duì)制劑中羥基紅花黃色素A提取得率的影響。

表1 提取條件考察

由此可知，以25%甲醇為提取溶劑，超聲處理40 min，效果較好，見(jiàn)表 1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品2.782 mg，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液4 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得6#對(duì)照品溶液；精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得5#對(duì)照品溶液；精密量取對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL量瓶中[3]，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得4#對(duì)照品溶液；精密量取對(duì)照品貯備液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得3#對(duì)照品溶液；精密量取3#對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻[4]，即得2#對(duì)照品溶液；精密量取2#對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得1#對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。每份溶液平行進(jìn)樣2次，求平均峰面積。以平均峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸[5]。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

羥基紅花黃色素A的回歸方程為Y=259 81 X-205 03（r=0.999 7），線性范圍為 3.20～102.27 μg/mL，見(jiàn)表2。

2.4 定量限與檢測(cè)限試驗(yàn)

以S/N≈10為標(biāo)準(zhǔn)，羥基紅花黃色素A的定量限為 1.60 μg/mL；以 S/N≈2～3 為標(biāo)準(zhǔn)，羥基紅花黃色素A的檢測(cè)限為0.40 μg/mL。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為170626的本品6份，研細(xì)，每份取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量[6]，用 25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。每份溶液平行進(jìn)樣2次，求平均峰面積。以平均峰面積照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法計(jì)算含量[7]。

見(jiàn)表3表4。

表3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 精密度試驗(yàn)

取“重復(fù)性試驗(yàn)”中第1份供試品溶液為研究對(duì)象。精密吸取該溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算平均峰面積和RSD，見(jiàn)表5。

表5 精密度試驗(yàn)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“重復(fù)性試驗(yàn)”中第1份供試品溶液為研究對(duì)象。精密吸取該溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。間隔若干時(shí)間進(jìn)樣1次，計(jì)算平均峰面積和RSD，見(jiàn)表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8 回收率試驗(yàn)

取批號(hào)為170 626的該品6份，研細(xì)，每份取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入羥基紅花黃色素 A 對(duì)照品溶液（265.59 μg/mL）1 μL 和 25%甲醇 24 μL，密塞，稱定重量[8]，超聲處理（功率 250 W，頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。每份溶液平行進(jìn)樣2次，求平均峰面積。以平均峰面積照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法計(jì)算[9-10]，見(jiàn)表7、表8。

表7 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照

表8 回收率試驗(yàn)

2.9 含量測(cè)定

取批號(hào)為 170 626、170 612、170 701 的本品，每批3份，研細(xì)，每份取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。每份溶液平行進(jìn)樣2次，求平均峰面積。以平均峰面積照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法計(jì)算含量。批號(hào)為170 626的樣品采用“重復(fù)性試驗(yàn)”前3份數(shù)據(jù)見(jiàn)表9、表10。

表9 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照

表10 含量測(cè)定

2.10 中間精密度

由該實(shí)驗(yàn)室另一名操作人員B，使用Kromasil C18 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）， 以批號(hào)為170626的樣品為研究對(duì)象，取3份，研細(xì)，每份取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率 50 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用 25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。每份溶液平行進(jìn)樣3次，求平均峰面積。以平均峰面積照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法計(jì)算含量，并與“重復(fù)性試驗(yàn)”前3份數(shù)據(jù)比較，見(jiàn)表11、表12。

表11 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照

表12 中間精密度

2.11 含量限度

批號(hào)為170 612、170 626、170 701的該品三批制劑中，羥基紅花黃色素A的平均含量分別為1.102 mg/g、1.070 mg/g、1.045 mg/g，三批的平均含量為 1.072 mg/g?？紤]到原料藥材產(chǎn)地、種植習(xí)慣、采收加工方法的差異和炮制方法的差異等因素?cái)M以“平均含量×80%”為含量限度，即不低于0.85 mg/g。見(jiàn)圖1。

圖1 含量限度

3 討論

3.1 耐用性試驗(yàn)

該試驗(yàn)的色譜條件參考2015年版 《中國(guó)藥典》“紅花”項(xiàng)下相關(guān)內(nèi)容。為配制方便，將流動(dòng)相從“甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液 （26：2：72）” 改為 “甲醇-0.7%磷酸溶液（30：70）”。在此基礎(chǔ)上，采用供試品溶液進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)，考察了色譜柱溫度 （28℃、32℃）、流速（1.05 mL/min、0.95 mL/min）、波長(zhǎng)（401 nm、405 nm）、流動(dòng)相組成比例（32：68、28：72）、進(jìn)樣量（9 μl、11 μl）對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述條件的微小變動(dòng)，對(duì)該試驗(yàn)中羥基紅花黃色素A的測(cè)定未造成影響。

3.2 空白試驗(yàn)

為考察該方中其它中藥飲片對(duì)紅花中羥基紅花黃色素A的測(cè)定是否存在干擾，該試驗(yàn)將紅花從處方中除去，其余飲片仍按照【處方】組成比例和制劑工藝制成缺紅花的空白制劑，并按照【含量測(cè)定】方法制成供試品溶液，依法測(cè)定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方中除紅花外的其它飲片，對(duì)制劑中羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾。

4 討論

采用高效液相色譜法測(cè)定主藥紅花中有效成份羥基紅花黃色素A的含量，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，陰性無(wú)干擾，可作為本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。HPLC法對(duì)紅花中的活性成份羥基紅花黃色素A進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。