李慧華， 余江南， 徐希明

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

苦瓜是全株入藥的食物，有“藥用蔬菜”之稱，特別是其果實(shí)和種仁有很強(qiáng)的藥理活性[1]?！侗静菥V目》中記載了苦瓜籽的氣味及藥效，稱其“苦甘無毒，益氣壯陽”。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從苦瓜籽中分離出多種蛋白質(zhì)、多肽、油脂等成分，并顯示出降血糖、抗腫瘤、抗病毒、降血脂及脂肪分解等藥理活性[2-4]。然而，研究苦瓜籽多糖成分的報(bào)道甚少，本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化苦瓜籽粗多糖(bitter melon seeds polysaccharide, BMSP)的提取工藝，并考察其體外抗氧化能力，為苦瓜籽的合理開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

苦瓜籽購自河南省洛陽市中藥材市場；無水乙醇、石油醚、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)、三氯乙酸、三羥甲基甲胺、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯化鐵、鹽酸、鄰苯三酚、維生素C、鐵氰化鉀等化學(xué)試劑均為分析純。

RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；L-550大容量離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；DHG-9245A 鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(上海普迪生物技術(shù)有限公司)。

1.2 苦瓜籽預(yù)處理

將干燥苦瓜籽粉碎后過80目篩，加入5倍體積的石油醚加熱回流3 h除去脂溶性物質(zhì)，抽濾后棄去上清液，低溫干燥濾餅以揮發(fā)掉石油醚，再加5倍體積的 95%乙醇加熱回流 3 h，抽濾后棄去上清液，50 ℃干燥濾餅，得苦瓜籽粉末以備多糖提取用。

1.3 改良苯酚-硫酸法[5]建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL葡萄糖溶液(濃度為1.0 mg/mL)于 25 mL的容量瓶中，加水至刻度線，配成濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別吸取60 μL各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[5]，平行取樣3次，加入180 μL 5%苯酚-硫酸溶液(即配即用)，渦旋1 min混勻，沸水浴加熱25 min，待反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，吸取200 μL加入96孔板中，以蒸餾水為參比，測定490 nm處光密度(D)值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007 5X+0.077 6，R2=0.999 3，表明葡萄糖濃度在10～100 μg/mL范圍有良好的線性關(guān)系。

1.4 BMSP的提取

稱取預(yù)處理的苦瓜籽粉末30 g(平行稱量3 份)于燒杯中，在一定條件下煎煮后，得到苦瓜籽水提液，濃縮至一定體積，加入4 倍體積的乙醇溶液，靜置12 h，離心后收集沉淀，再依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌2次，最終完全溶解于水中，離心，上清液凍干得BMSP沉淀。

吸取 60 μL 2.5 mg/mL BMSP沉淀溶液，按“1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，測定490 nm處的D值，可根據(jù)D值適當(dāng)稀釋，再測定，并代入方程得出多糖濃度，最后代入下列公式計(jì)算BMSP得率。

多糖提取率=(提取的多糖質(zhì)量/苦瓜籽質(zhì)量)×100。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

以脫脂后的苦瓜籽粉末為原料，采用熱水煎煮法提取BMSP。影響B(tài)MSP提取的主要因素有提取溫度、時(shí)間、料液比和次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)提取溫度選取 60、70、80、90、100 ℃共5個(gè)水平，提取時(shí)間選取 1、1.5、2、2.5、3 h 這5個(gè)水平，苦瓜籽與水的料液比選取 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 這5個(gè)水平，選取提取次數(shù) 1、2、3、4 次4個(gè)水平，分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.6 正交設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)和提取次數(shù)(D)這4個(gè)因素，每個(gè)因素下各3個(gè)水平，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以多糖提取率為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)提取工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.7 BMSP沉淀中的蛋白質(zhì)去除

因BMSP中含有的苦瓜籽蛋白具有較強(qiáng)抗氧化能力，會影響B(tài)MSP的抗氧化活性研究。因此我們參照文獻(xiàn)[6]中的方法，采用三氯乙酸脫蛋白法去除BMSP沉淀中的蛋白質(zhì)。稱取適量的BMSP沉淀完全溶解于200 mL蒸餾水中，邊攪拌邊緩慢加入三氯乙酸溶液，使三氯乙酸的最終濃度為3%，其間不斷攪拌3 h，使蛋白質(zhì)完全沉淀，再靜置2 h后，下層有蛋白質(zhì)層析出。離心后棄去蛋白沉淀，將上清液收集濃縮，透析后凍干得BMSP。

1.8 考馬斯亮藍(lán)法測定BMSP中蛋白質(zhì)含量[7]

精密吸取牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(濃度為100 μg/mL)0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL試管中，加入4 mL 0.01%考馬斯亮藍(lán)溶液G-250，加水補(bǔ)足至10 mL，混勻，室溫靜置25 min，檢測595 nm處的D值。以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制濃度為1.5 mg/mL BMSP多糖溶液，按“1.3”項(xiàng)下操作方法，檢測595 nm處D值。BMSP中蛋白質(zhì)的含量=Wi/W×100%(Wi為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的蛋白質(zhì)質(zhì)量，W為BMSP質(zhì)量)。

1.9 BMSP抗氧化活性測定

1.9.1 清除 DPPH自由基能力的測定[8-9]稱取適量DPPH溶解于無水乙醇中配制成0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，分別吸取0.1，0.2,0.5,1,2,3 mg/mL BMSP溶液2 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混合搖勻，常溫避光放置30 min，3 500 r/min離心10 min。取多糖上清液檢測517 nm處D值。采用無水乙醇溶液作為空白對照，維生素C為陽性對照，計(jì)算BMSP的清除率(%)，每個(gè)濃度平行做3次實(shí)驗(yàn)。DPPH清除率=[1-(D多糖組-D對照組)/D空白組]×100。

1.9.2 Fenton反應(yīng)法檢測羥自由基(·OH)清除率[10]在10 mL試管中依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，2 mL pH=7.4的 PBS和1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，邊加邊搖勻，再分別加入0.1，0.2,0.5,1,2,3 mg/mL 2 mL BMSP多糖溶液和1 mL 0.3%H2O2，用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL，于 37 ℃水浴反應(yīng) 1 h，于510 nm處測定D值?？瞻讓φ諡榫彌_溶液-蒸餾水(V∶V=1 ∶2)溶液，陽性對照為維生素C?！H清除率=[(D多糖組-D對照組)/D空白組-D多糖組]×100。

1.9.4 普魯士藍(lán)法檢測總還原能力[12]在10 mL離心管中分別加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖液2.5 mL和BMSP溶液1 mL(濃度分別為0.1,0.2,0.5,1,2,3 mg/mL)，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，3 500 r/min離心10 min。取出上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測D值，以蒸餾水代替0.1%三氯化鐵溶液作為空白對照。還原能力=D多糖組-D空白組。

2 結(jié)果

2.1 提取溫度

從圖1可以看出，提取溫度在60～100 ℃范圍內(nèi)，多糖提取率呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在90 ℃時(shí)多糖提取率最高，達(dá)5.18%，可能是由于當(dāng)溫度較低時(shí)，多糖的溶解與滲透能力較低。在相同提取時(shí)間內(nèi)，溫度較低時(shí)BMSP不能有效溶出，而溫度較高時(shí)多糖分子結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生一定的破壞，從而導(dǎo)致多糖提取率降低?？紤]100 ℃時(shí)水分揮發(fā)快，不能完全浸潤提取，且多糖結(jié)構(gòu)可能已被破壞，對后面的結(jié)構(gòu)解析有一定影響。最終確定最佳提取溫度為90 ℃。為了進(jìn)一步考察提取溫度對BMSP提取率的影響，選取70、80、90 ℃這3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化分析。

圖1 不同提取溫度對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.2 提取時(shí)間

從圖2可以看出，當(dāng)提取時(shí)間從1 h增加到2 h時(shí)，BMSP提取率快速上升，到2 h時(shí)達(dá)到最大值，為4.61%，當(dāng)超過2 h，多糖提取率反而降低。這可能是時(shí)間越長，多糖溶出的量越大，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓逐漸趨于平衡，多糖溶出量緩慢，但浸提時(shí)間過長可能會致多糖鏈斷裂，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致多糖的溶出量減少，或因?yàn)槠渌煞直惶崛〕鰜碛绊懥颂崛÷?。故選取1.5 h、2 h、2.5 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化分析。

圖2 不同提取時(shí)間對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.3 料液比

從圖3可以看出，當(dāng)料液比從1 ∶10增大到1 ∶30時(shí)，BMSP提取率呈上升趨勢；當(dāng)料液比為1 ∶50時(shí)，達(dá)到最大值4.95%；繼續(xù)增大料液比，BMSP提取率基本保持平穩(wěn)，上升幅度不明顯?？紤]到各因素間相互作用的影響，選取 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50共3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化分析。

圖3 不同料液比對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.4 提取次數(shù)

從圖4可以看出，隨著提取次數(shù)增加，BMSP的提取率先呈直線上升再趨于平緩，提取4次與3次的多糖提取率基本保持不變。這可能是在前3次的提取中，幾乎90%的多糖被提取出來，再增加提取次數(shù)，對多糖的提取率影響不大。除此之外，考慮到提取過程中消耗的成本和時(shí)間，故選取2、3、4次共3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化分析。

圖4 不同提取次數(shù)對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定4因素3水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 4因素3水平表

從正交實(shí)驗(yàn)的極差(R)結(jié)果(表2)可知，各因素的影響順序?yàn)镃

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2的極差(R)和表3的偏差平方和的結(jié)果相一致，各因素的影響順序C

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證最優(yōu)工藝的正確性和合理性，以理論上最優(yōu)工藝提取苦瓜籽多糖，平行實(shí)驗(yàn)3次，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果，苦瓜籽多糖的平均提取率為5.65%，RSD=2.13%(n=3)?？紤]到成本和后續(xù)濃縮等問題，結(jié)合極差和方差結(jié)果分析料液比對多糖的提取率的影響相對較小，故選取最小比例的料液比，此時(shí)提取率達(dá)5.61%。最終確定最佳工藝條件為提取溫度90 ℃，提取時(shí)間2.5 h，料液比1 ∶30，提取次數(shù)3次。

2.7 蛋白質(zhì)含量

以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，D(595 nm)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，蛋白濃度與D值有較好的線性相關(guān)性，方程式為Y=0.030 9X+0.008 4，R2=0.999 9。最終求出BMSP中蛋白質(zhì)含量為1.09%。

圖5 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.8 抗氧化活性

2.8.1 DPPH自由基清除率 從圖6可以看出，BMSP對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，其中在3 mg/mL時(shí)，BMSP和維生素C的清除率相近，分別為81%和90%。

圖6 苦瓜籽粗多糖與維生素C對DPPH自由基的清除率

2.8.2 ·OH清除率 Fenton反應(yīng)結(jié)果顯示，BMSP對鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系產(chǎn)生的·OH具有清除作用，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)良好劑量依賴性，最高能達(dá)到50%，相同濃度下的清除能力略低于維生素C。見圖7。

圖7 苦瓜籽粗多糖與維生素C對羥自由基的清除率

圖8 苦瓜籽粗多糖與維生素C對的清除作用

2.8.4 總還原能力 普魯士藍(lán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSP具有較強(qiáng)的還原能力，且還原能力隨著多糖的濃度的增加而不斷增大；濃度從1 mg/mL增大到3 mg/mL，BMSP的還原能力緩慢增加，最高D值達(dá)0.65，但是與維生素C相比，還是相差很大。見圖9。

圖9 苦瓜籽粗多糖與維生素C的總還原能力比較

3 討論

本研究從藥食同源植物苦瓜的種仁苦瓜籽中提取多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定了多糖提取的最佳工藝，BMSP的提取率高達(dá)5.61%，為后續(xù)分離純化苦瓜籽多糖提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。因多糖在分離純化過程中損失量大，后期采用超聲或者微波等新型技術(shù)輔助提取以提高BMSP提取率。

本實(shí)驗(yàn)采用4種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)方法，以自由基清除率為指標(biāo)，分別評價(jià)BMSP和維生素C體外抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)表明，BMSP具有較強(qiáng)的抗氧化活性，隨著濃度的增大，當(dāng)濃度增加到1 mg/mL后抗氧化活性的增強(qiáng)緩慢。用不同方法檢測BMSP抗氧化活性的結(jié)果具有一定差異，但BMSP對DPPH自由基和·OH清除能力，與強(qiáng)抗氧化劑維生素C相近，在天然抗氧化劑的研究開發(fā)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。多糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)中的半縮醛羥基數(shù)目、糖鏈結(jié)構(gòu)及相對分子質(zhì)量等有關(guān)[15]。對BMSP的進(jìn)一步分離純化和構(gòu)效關(guān)系的探討將有助于促進(jìn)苦瓜籽藥材的開發(fā)和利用。