陳星光， 鄒承達(dá)， 宿廣昊， 張亞， 陸敏華， 王曉東

(蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 1. 兒科臨床研究院， 2. 骨科 江蘇 蘇州 215025； 3. 蘇州市獨(dú)墅湖醫(yī)院骨科， 江蘇 蘇州 215025)

關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏血管及神經(jīng)，損傷后在缺乏外界干預(yù)的情況下可能加重關(guān)節(jié)磨損，繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響患者的工作及生活[1]。因此，軟骨損傷修復(fù)一直是臨床研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。近年來組織工程技術(shù)的發(fā)展為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷帶來了新的曙光。殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate, β-GP)溫敏水凝膠是近年來軟骨修復(fù)的研究熱點(diǎn)。Chenite等[3]于2000年提出了殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏水凝膠體系。該水凝膠制備溫和，完全保持了殼聚糖本身的優(yōu)點(diǎn)，且能向處于液態(tài)的混合液中加入藥物[4]、細(xì)胞因子甚至活的細(xì)胞，受到學(xué)者的高度關(guān)注。

富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)是由法國(guó)學(xué)者Choukroun等[5]于2000年首先報(bào)道的第2代血小板濃縮物。PRF來源于自體，具有極高的生物安全性，現(xiàn)已被視為一種改善愈合和促進(jìn)組織再生的新型自體來源生物材料[6]。前期研究[7]我們發(fā)現(xiàn)負(fù)載PRF的新型水凝膠理化性質(zhì)良好，能夠緩釋包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子，并且具有良好的組織相容性。本次實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究負(fù)載PRF的新型水凝膠在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成軟骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：體重在0.5 kg左右的3～4周齡健康新西蘭大白兔，購(gòu)自蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013—0002]，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)匯編2009年版》[8]；所用兔BMSCs由本實(shí)驗(yàn)室自行分離、培養(yǎng)并經(jīng)過鑒定[7, 9]。

試劑：相對(duì)分子質(zhì)量為20萬(wàn)的殼聚糖(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；β-GP(美國(guó)Sigma公司)；京尼平(上海源葉生物科技有限公司)；兔Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(英國(guó)Abcam公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclon公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；軟骨誘導(dǎo)液(DMEM/F12、10% 胎牛血清、6.25 mg/L胰島素、50 mg/L維生素C、10 μg/L TGF-β1)。

儀器：離心機(jī)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 殼聚糖溫敏水凝膠的制備

配制56%的β-GP水溶液，2%的殼聚糖醋酸溶液，0.1%的京尼平水溶液。向殼聚糖溶液中加入京尼平溶液，冰浴條件下，向殼聚糖/京尼平混合液中逐滴加入β-GP溶液，使殼聚糖、β-GP、0.1%京尼平三者體積比為6 ∶1 ∶1，邊滴加邊搖勻，靜置10 min后將混合液置入37 ℃恒溫水浴箱中，觀察并記錄其成膠時(shí)間。

1.3 PRF及其凍干粉末的制備

經(jīng)兔耳緣靜脈抽取5 mL血液于15 mL離心管后立即離心(1 200 r/min，12 min)，可見血液分為3層結(jié)構(gòu)(上層血清層、中層PRF層、下層紅細(xì)胞層)，倒去血清層，用鑷子夾出中間層，用無菌剪刀剪去殘余的紅細(xì)胞層，即可得主要呈白色凝膠狀的PRF；將PRF置于-80 ℃冰箱冷凍24 h，再置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干(-88 ℃，0.011 kPa)，制得凍干PRF；用研缽將凍干PRF研磨成粉末，再加入0.5 mL培養(yǎng)液充分溶解，22 μm濾器過濾除菌，備用。

1.4 負(fù)載PRF的殼聚糖溫敏水凝膠的制備

向1.5 mL 2% 殼聚糖溶液中加入0.1%京尼平溶液0.25 mL后搖勻，加入過濾后的PRF溶液0.05 mL，再于冰浴條件下加入56% β-GP溶液0.25 mL，置于恒溫水浴箱中成膠。

1.5 FDA熒光染色法[10]觀察BMSCs在水凝膠表面的生長(zhǎng)情況

將BMSCs接種于12孔板，每孔預(yù)先加入已成膠的負(fù)載PRF的新型殼聚糖水凝膠，恒溫箱培養(yǎng)；在第1、3、7 d棄培養(yǎng)液避光加入FDA熒光染色工作液(1 mL PBS中含有2 μL FDA染液)，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)并拍照。

1.6 兔BMSCs成軟骨誘導(dǎo)

將細(xì)胞分為負(fù)載PRF的新型水凝膠組(PRF組)、殼聚糖水凝膠組(殼聚糖組)以及單純誘導(dǎo)組(僅加入軟骨誘導(dǎo)液)。將細(xì)胞接種于24孔板中，2～3 d后換液，更換誘導(dǎo)液的同時(shí)加入相應(yīng)支架材料，誘導(dǎo)2周后隨機(jī)選擇12孔加入低聚甲醛固定細(xì)胞并進(jìn)行HE染色、番紅O-固綠染色、阿利新藍(lán)染色、兔Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察軟骨分化情況。其余細(xì)胞誘導(dǎo)至第4周結(jié)束，誘導(dǎo)期間每2～3 d換液并收集上清液。

1.7 軟骨分化情況的染色觀察

1.7.1 HE染色 棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，室溫干燥后加入蘇木素染15 min；水洗1次，加入分化液分化20～30 s，再加入自來水浸泡15 min或50 ℃左右溫水浸泡5 min后棄浸泡液；加入伊紅染液染1.5 min，水洗1次后，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7.2 番紅O-固綠染色[11]待孔板內(nèi)細(xì)胞自然干燥，用蘇木素染3 min；PBS漂洗1次，1%鹽酸乙醇分化(1 mL鹽酸+99 mL 75%乙醇)；水洗1次，0.2%固綠染5 min；水洗1次，0.1%番紅O染液染1～2 min；水洗1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7.3 阿利新藍(lán)染色[12]將97 mL蒸餾水、3 mL冰醋酸和1 g阿利新藍(lán)混勻制成染液，取適量染液均勻加入孔板中，過夜。次日棄去染液，PBS漂洗1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7.4 兔Ⅱ型膠原免疫組化染色 向孔板中加入過氧化氫阻斷液，孵育10 min；PBS洗3次，加入鼠抗兔IgG(一抗)，4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，加入生物素化的羊抗鼠IgG(二抗)，室溫孵育10 min；PBS洗3次，加入鏈霉素過氧化物酶，室溫孵育10 min；PBS洗3次。向1 mL DAB底物中加入20 μL DAB顯色劑，混勻后加入孔板中，孵育10 min；PBS洗3次后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 阿利新藍(lán)比色法[13]檢測(cè)上清液中糖胺聚糖含量

配制40、20、10 μg/mL的硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取標(biāo)準(zhǔn)品和上清液各100 μL加入1.5 mL EP管中，再分別加入8 mol/L 鹽酸胍50 μL，搖勻后加入50 μL試劑1(0.75% Triton X-100，3% H2SO4)，搖勻后靜置15 min；再加入650 μL低溫試劑2(將試劑1用蒸餾水稀釋3倍)后過夜；過夜后的溶液離心(12 000×g，15 min)，取740 μL上清液至新EP管中；加入500 μL阿利新藍(lán)染液(0.08% 阿利新藍(lán)，0.25% Triton X-100，0.5 mol/L鹽酸胍)，搖勻后靜置6 h以上；離心(12 000×g，15 min)后棄上清液，加入750 μL DMSO洗液(40% DMSO，0.03 mol/L MgCl2)，振蕩半小時(shí)后離心(12 000×g，15 min)，再棄上清液，重復(fù)操作1次；加入500 μL分散液(4 mol/L鹽酸胍，33%正丙醇)，振蕩15 min后加入96孔板中(每孔240 μL)，在600 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(D)值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品D值求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，各樣品檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出該樣品上清液中糖胺聚糖含量。

1.9 ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)上清液中Ⅱ型膠原含量

分別將上清液或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)加入相應(yīng)孔中，用封板膠封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min；洗板5次，在吸水紙上拍干，加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用封板膠封住反應(yīng)孔，室溫孵育60 min；洗板5次，拍干，加入酶結(jié)合物工作液100 μL/孔，封板膠封住反應(yīng)孔，避光室溫孵育20 min；洗板5次，拍干，加入顯色劑TMB 100 μL/孔，避光室溫孵育20 min；加入終止液50 μL/孔，混勻后立即測(cè)D(450 nm)值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 水凝膠外觀

含有京尼平的混合液在37 ℃下約8 min形成藍(lán)色不透明的水凝膠，其機(jī)械強(qiáng)度較好，能夠被切割塑形。見圖1。

圖1 含有京尼平的殼聚糖溫敏水凝膠外觀

2.2 BMSCs在水凝膠表面的生長(zhǎng)情況

按預(yù)定時(shí)間進(jìn)行FDA染色，在熒光倒置顯微鏡下可看到BMSCs在凝膠表明的生長(zhǎng)狀況。由于FDA可在活細(xì)胞內(nèi)被脂酶分解成能自由透過細(xì)胞膜的產(chǎn)生綠熒光的熒光素，故可觀察細(xì)胞活性。由圖2可見，F(xiàn)DA染色效果滿意，細(xì)胞形態(tài)好，表明細(xì)胞活性較好；同時(shí)細(xì)胞能夠在水凝膠表面以較高的速率增殖。

圖2 殼聚糖水凝膠表面BMSCs的生長(zhǎng)情況(熒光倒置顯微鏡×40)

2.3 軟骨分化染色結(jié)果

2.3.1 HE染色結(jié)果 PRF組中出現(xiàn)大量多個(gè)核細(xì)胞，部分細(xì)胞的核融合成較大的細(xì)胞核，細(xì)胞周圍染色清晰，界限清楚，可見細(xì)胞大體呈均勻一致的多邊形結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)梭狀的細(xì)胞較少，間或夾雜于類軟骨樣細(xì)胞中，較難辨別。殼聚糖組和單純誘導(dǎo)組亦可見多個(gè)核細(xì)胞，但數(shù)量較PRF組少，多個(gè)核細(xì)胞周圍染色清晰，界限清楚，細(xì)胞大體呈多邊形結(jié)構(gòu)，但可見大量未分化的呈長(zhǎng)梭形的細(xì)胞。見圖3。

2.3.2 番紅O-固綠染色結(jié)果 PRF組中大量細(xì)胞被成功染色，且染色程度深，說明細(xì)胞周圍分泌大量糖胺聚糖；殼聚糖組和單純誘導(dǎo)組已染色部分顏色較淺，甚至有部分細(xì)胞脫色，說明細(xì)胞所分泌糖胺聚糖含量較少，此外，殼聚糖組、單純誘導(dǎo)組中亦可見大量未能染色區(qū)域。見圖4。

圖3 成軟骨誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞HE染色情況(×100)

圖4 成軟骨誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞番紅O-固綠染色(×100)

2.3.3 阿利新藍(lán)染色結(jié)果 PRF組中大量細(xì)胞被成功染色，染色程度深且均勻，說明細(xì)胞周圍分泌大量糖胺聚糖；殼聚糖組和單純誘導(dǎo)組中可見部分細(xì)胞未能成功染色，已染色部分顏色較淺且不均勻，部分區(qū)域無明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)，考慮可能為其他細(xì)胞外基質(zhì)殘留成分所導(dǎo)致的染色。阿利新藍(lán)染色結(jié)果與番紅O-固綠染色結(jié)果較為一致。見圖5。

圖5 成軟骨誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞阿利新藍(lán)染色(×200)

2.3.4 兔Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果 3組中均有大量Ⅱ型膠原被成功染色。相比較而言，PRF組染色程度深且均勻，說明細(xì)胞周圍分泌了大量的Ⅱ型膠原；殼聚糖組和單純誘導(dǎo)組染色情況亦較為滿意，但染色程度較PRF組淺且不均勻，部分區(qū)域仍可見梭形細(xì)胞，考慮為BMSCs或成纖維細(xì)胞。見圖6。

圖6 成軟骨誘導(dǎo)2周后各組細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化染色(×100)

2.4 上清液中糖胺聚糖含量

硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.001 2X+0.049 5 ，該方程與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度高(R2=0.999)。根據(jù)D值求得各組細(xì)胞分泌糖胺聚糖結(jié)果見圖7，可見在4周內(nèi)，PRF組分泌糖胺聚糖的能力均高于殼聚糖組與單純誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，殼聚糖組與單純誘導(dǎo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中糖胺聚糖的含量(n=5)

2.5 上清液中Ⅱ型膠原含量

試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.101 9X+0.103，該方程與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度高(R2=0.957 27)。根據(jù)D值求得各組細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原結(jié)果如圖8。在4周內(nèi)，PRF組分泌Ⅱ型膠原的能力均高于殼聚糖組與單純誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，殼聚糖組與單純誘導(dǎo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖8 3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅱ型膠原的含量(n=5)

3 討論

軟骨損傷修復(fù)在骨科仍是一大難題，目前國(guó)內(nèi)外研究雖多，但尚無滿意的治療手段[14]。隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，軟骨組織工程技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損成為具有廣闊前景的技術(shù)手段之一[15-16]。

殼聚糖分子式類似于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖，因而在軟骨組織工程領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注[17]?；跉ぞ厶堑臏孛籼匦?，結(jié)合外科的微創(chuàng)理念，有學(xué)者提出可在臨床中采用注射的方法進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。目前所制備的殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏水凝膠強(qiáng)度較低，采用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)可以增加強(qiáng)度，但由于戊二醛細(xì)胞相容性差，修復(fù)效果并不十分令人滿意。京尼平相較于甲醛、戊二醛、二異氰酸鹽等化學(xué)交聯(lián)劑的細(xì)胞毒性大大減小，具有良好的細(xì)胞相容性[18]，被作為一種天然的生物交聯(lián)劑而得到了廣泛應(yīng)用[19]。采用京尼平作為交聯(lián)劑能夠有效增加殼聚糖溫敏水凝膠的強(qiáng)度，并且基本沒有細(xì)胞毒性。

PRF是在不添加抗凝劑的情況下，離心外周血而制備的一種血液制品，PRF中含有TGF-β1、IGF-1、VEGF等生長(zhǎng)因子。制備原理是通過離心使血液中不同沉降系數(shù)及浮力密度的成分分層，與富血小板血漿的制備相比，該方法極大地簡(jiǎn)化了操作，更適合臨床應(yīng)用。我們?cè)谘芯恐胁捎? 200 r/min離心12 min制備PRF，結(jié)果令人滿意。

我們的課題充分考慮臨床應(yīng)用，通過京尼平增加殼聚糖分子鏈內(nèi)部交聯(lián)強(qiáng)度，再向其中加入甘油磷酸鈉，借助混合液的溫敏特性制備一種在常溫下保持液態(tài)、在體溫下能盡快凝膠且具有一定力學(xué)強(qiáng)度的可注射溫敏水凝膠。在前期實(shí)驗(yàn)[7]中，我們已經(jīng)證明了殼聚糖/β-GP/京尼平溫敏水凝膠強(qiáng)度較殼聚糖/β-GP溫敏水凝膠強(qiáng)，能夠在一定程度上切割塑形；負(fù)載PRF的新型水凝膠也能夠緩釋IGF-1、TGF-β1等生長(zhǎng)因子。有研究表明[20]添加外源性TGF-β1和IGF-1可在體外促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞成軟骨分化，TGF-β1的誘導(dǎo)效果強(qiáng)于IGF-1，并且同時(shí)使用兩種生長(zhǎng)因子時(shí)還具有協(xié)同作用。

蛋白多糖及膠原是軟骨基質(zhì)的主要成分，而糖胺聚糖和Ⅱ型膠原則是關(guān)節(jié)軟骨所特有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在調(diào)節(jié)軟骨功能及維持細(xì)胞表型方面具有重要作用。在進(jìn)行BMSCs成軟骨誘導(dǎo)后的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原定量檢測(cè)中，負(fù)載PRF的新型水凝膠與僅含有殼聚糖水凝膠或單純誘導(dǎo)者相比均具有明顯優(yōu)勢(shì)。說明殼聚糖本身并無促進(jìn)BMSCs成軟骨分化的作用，而PRF中所含有的多種生長(zhǎng)因子在成軟骨誘導(dǎo)液的參與下，具有一定的促進(jìn)BMSCs成軟骨分化的作用。成軟骨誘導(dǎo)染色時(shí)，PRF組HE染色可見大量的多個(gè)核細(xì)胞，但殼聚糖組與單純誘導(dǎo)組內(nèi)仍有大量的未能夠成功誘導(dǎo)的長(zhǎng)梭形細(xì)胞；番紅O-固綠和阿利新藍(lán)染色以及Ⅱ型膠原免疫組化染色則分別證實(shí)了細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)含有大量糖胺聚糖及Ⅱ型膠原。

綜上，本研究所制備的負(fù)載PRF的新型溫敏水凝膠細(xì)胞相容性較好，兔BMSCs能夠在其表面生長(zhǎng)、增殖；該水凝膠能夠在一定程度上促進(jìn)BMSCs成軟骨分化，具有修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的應(yīng)用前景。